本发明涉及生物医学,具体地说,是关于一种用于治疗青光眼的病毒包装质粒及其制备方法和应用。
背景技术:
1、青光眼是一组复杂的视神经疾病,其定义为视网膜神经节细胞(rgcs)及其轴突在视神经内的损失。青光眼是人类和动物视力下降的主要原因。而眼压(iop)升高是导致视网膜神经节细胞(rgcs)及其轴突丢失的主要危险因素。因此,如何控制眼压以及保护视功能是青光眼治疗所面临的重要问题。由于目前尚无确定的视神经保护治疗方法,降眼压是现阶段该病的主要治疗方法,主要是通过降低房水的产生和增加房水的排出,但患者接受治疗后,视力仍会下降。
2、随着技术的发展,以及对青光眼疾病机制和风险因素研究的深入,研究者发现基因治疗对青光眼具有持久治疗效果的潜力。眼基因治疗是指将dna或rna等遗传物质引入眼细胞,改变基因表达,达到治疗效果,基因治疗已被应用于一些遗传性视网膜营养不良和老年性黄斑病变(adm)的临床治疗。一种常见的、有效的将遗传物质注入眼睛的方法是使用腺相关病毒(aav)载体。
3、腺相关病毒是(adeno associated virus,aav)是一种小的单链dna病毒,可在人体内传播,由于其缺乏固有的免疫原性、持续的转基因表达、易于使用(相对于其他载体平台,载体构建物的克隆非常快速和容易)以及在眼睛中的临床相关性,使其成为基因传递的首选载体。而转入和靶向转基因表达到某一细胞类型的能力是由病毒载体的细胞向性决定的,这受病毒衣壳和血清型以及置于转基因前面的启动子调控序列的影响。
4、青光眼基因治疗目前最常用的注射方法有视网膜下注射和玻璃体内注射,但这些注射途径可能不适合前段组织的转导。有相关研究表明,在前房内传递腺相关病毒载体后,在小梁网中能产生有效的长期的基因表达,而对眼周组织的影响有限。基因传递到组织既需要可靠的注射技术,也需要能够在体内有效转导靶细胞的aav载体。
5、目前,关于aav介导的小梁网或角膜转导的研究大都集中在未改良的第一代血清型aav1-aav9上。已有研究证明:aav2血清型可用于靶向小梁网和角膜;在经过房内注射后,anc80l65是在原始序列重建的基础上设计合成的,能够有效地转导小鼠前段的所有成分,包括小梁网细胞、角膜基质和内皮细胞;aav2/dj血清型是由八种现有血清型(aav2、4、5、8、9、禽流感、山羊和牛)之间的衣壳混合而成,在小鼠视网膜内外均能有效诱导目标基因,且无功能性毒性;aav-9是视网膜基因传递的有效载体,视网膜下aav-9给药没有引起明显的急性视网膜损伤,aav-9介导的外丛状层转导有望治疗主要影响该层的疾病。但是还没有研究评价过这四种aav血清型在小鼠眼前节的感染效率及组织选择性。
技术实现思路
1、针对现有青光眼的基因治疗方法所存在的上述缺点,本发明致力于提供一种更有效的治疗方案。
2、为实现上述目的,本发明的第一个方面,提供了一种用于治疗青光眼的病毒包装质粒,包括由腺相关病毒aav包装的含青光眼治疗基因的质粒,其中,所述腺相关病毒aav为aav-dj血清型。
3、根据本发明的优选实施例,所述青光眼治疗基因为编码血管生成素1的重组变体comp-ang1的基因comp-ang1,其核苷酸序列如seq id no.1所示。
4、进一步的,所述含青光眼治疗基因的质粒是通过将编码血管生成素1的重组变体comp-ang1的基因comp-ang1插入质粒phbaav-cmv-mcs-3flag-t2a-zsgreen的多克隆位点而得到。
5、本发明的第二个方面,提供了一种病毒包装质粒的制备方法,包括以下步骤:
6、步骤一:将青光眼治疗基因插入表达质粒的多克隆位点,得到含青光眼治疗基因的重组质粒;
7、步骤二:将步骤一得到的重组质粒转染aav-293细胞,得到由腺相关病毒aav包装的含青光眼治疗基因的质粒;
8、其中,所述腺相关病毒aav为aav-dj血清型。
9、根据本发明,步骤一中所述表达质粒为phbaav-cmv-mcs-3flag-t2a-zsgreen。
10、根据本发明的优选实施例,步骤一中所述青光眼治疗基因为编码血管生成素1的重组变体comp-ang1的基因comp-ang1,其核苷酸序列如seq id no.1所示。
11、本发明的第三个方面,提供了所述病毒包装质粒用于制备治疗青光眼的药物的应用。
12、本发明具有以下有益效果:
13、1、本发明通过对多种不同aav血清型的比较,优选出了具有较高病毒感染效率及组织选择性的aav-dj血清型用于包装病毒,有助于提升治疗效果。
14、2、本发明首次采用腺相关病毒aav包装含青光眼治疗基因的质粒,经动物实验证明能够显著降低眼压,并且使得房水流出更容易,为治疗青光眼开发了一种新的治疗手段。
1.一种用于治疗青光眼的病毒包装质粒,其特征在于,所述病毒包装质粒包括由腺相关病毒aav包装的含青光眼治疗基因的质粒,其中,所述腺相关病毒aav为aav-dj血清型。
2.根据权利要求1所述的病毒包装质粒,其特征在于,所述青光眼治疗基因为编码血管生成素1的重组变体comp-ang1的基因comp-ang1,其核苷酸序列如seq id no.1所示。
3.根据权利要求2所述的病毒包装质粒,其特征在于,所述含青光眼治疗基因的质粒是通过将编码血管生成素1的重组变体comp-ang1的基因comp-ang1插入质粒phbaav-cmv-mcs-3flag-t2a-zsgreen的多克隆位点而得到。
4.权利要求1-3中任一项所述的病毒包装质粒的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,步骤一中所述表达质粒为phbaav-cmv-mcs-3flag-t2a-zsgreen。
6.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,步骤一中所述青光眼治疗基因为编码血管生成素1的重组变体comp-ang1的基因comp-ang1,其核苷酸序列如seq id no.1所示。
7.权利要求1-3中任一项所述的病毒包装质粒的应用,其特征在于,用于制备治疗青光眼的药物。