一种检测肺腺癌铁死亡敏感性的试剂盒

1.本发明属于生物检测领域，涉及一种检测肺腺癌铁死亡敏感性的试剂盒。


背景技术：

2.肺腺癌作为最为常见、死亡率最高的肿瘤之一，发病率和死亡率均排名所有肿瘤前列。对于肺腺癌手术后肿瘤合并局部淋巴结转移和晚期患者，化疗和放疗是非常重要的治疗手段。然而化疗耐药和放疗抵抗的产生极大程度地限制了它们的疗效,导致治疗失败以及肿瘤的复发转移。新兴的细胞铁死亡机制则可以缓解这种治疗抵抗。通过在肿瘤中尤其是耐药的细胞中诱导铁死亡，无论是作为单一疗法，还是与其他化疗药物或放射治疗联合使用，对于患者的治疗效果、减轻患者经济负担和国家财政负担具有重要的临床指导意义。
3.然而，目前临床上还缺乏有效的诊断手段用来判定哪些肺腺癌患者对铁死亡诱导剂药物治疗具有敏感性，导致无法对其实施精准医疗。


技术实现要素：

4.为了寻找可用于诊断肺腺癌铁死亡敏感性的生物标志物，发明人基于生物信息学的统计数据，对于与肺腺癌、尤其是肺腺癌铁死亡有关的高表达和低表达的蛋白质或基因进行了广泛筛选，意外地发现个别基因在肺腺癌铁死亡事件中发生高表达或者低表达，经过实验验证，确认maff基因(nm_012323.4)的高表达可以作为肺腺癌铁死亡敏感性的指征。因此，本发明包括如下技术方案：
5.一种检测肺腺癌铁死亡敏感性的试剂盒，其包括：用于从肺腺癌患者肿瘤组织中提取分离mrna的mrna提取分离系统；用于maff基因(nm_012323.4)的mrna表达量的maff基因检测系统；记载用于确定maff表达量高/低分界标准的数学模型载体，当肺腺癌患者肿瘤组织中maff表达量高于所述分界标准时，提示患者对铁死亡诱导剂药物治疗敏感；反之当低于所述分界标准时，提示患者对铁死亡诱导剂药物治疗不敏感、或者出现治疗抵抗。
6.在一种实施方式中，上述数学模型载体是说明书，其可以写在瓶子、试管和类似物上，或者写在一张单独的纸上，或者在容器的外部或内部，例如是带有操作演示视频app下载窗口比如二维码的纸件，说明书也可以是多媒体的形式，比如cd、u盘、网盘等
7.上述数学模型为：基因maffmrna表达量表示为qpcr.ct＝qpcr.ct.maff-qpcr.ct.内参，即从肺腺癌患者肿瘤组织中提取的maff进行定量pcr的ct值与内参的ct值之差。
8.所述内参选自是actb(β-actin)、gapdh、18srna等。更优选actb作为内参对照。
9.当内参是actb时，基因maffmrna表达量表示为qpcr.ct＝qpcr.ct.maff-qpcr.ct.actb，所述分界标准为：qpcr.ct取13.0为临界值，如果＜13.0，则maff基因高表达，提示患者对铁死亡诱导剂药物治疗敏感；如果≥13.0，则maff基因低表达，提示患者对铁死亡诱导剂药物治疗不敏感，或者出现治疗抵抗。
10.可选地，当内参基因是除actb外的其它内参基因比如gapdh、18srna时，qpcr.ct临
界值及高/低分界标准需要作出适当改变。
11.优选上述的试剂盒还包括用于将mrna逆转录成cdna的mrna逆转录系统。
12.例如，上述mrna逆转录系统可以是翌圣生物科技(上海)股份有限公司的ii1st strand cdna synthesis supermix for qpcr(gdna digester plus)试剂。
13.优选地，上述的试剂盒进一步包括用于进行qpcr实验检测maff基因表达量的qpcr试剂即maff基因检测系统。
14.例如，上述qpcr试剂可以是翌圣生物科技(上海)股份有限公司的qpcr sybr green master mix(low rox plus)。
15.在一种实施方式中，上述qpcr试剂中maff基因的qpcr扩增引物序列包括：
16.正向引物：5
’‑
gcgagagctgagcgagaaca-3’；
17.反向引物：5
’‑
tgcttgagccgtgtcacctc-3’。
18.上述qpcr试剂中内参actb基因的qpcr引物序列可以为：
19.正向引物：5
’–
tgacgtggacatccgcaaag-3’；
20.反向引物：5
’–
ctggaaggtggacagcgagg-3’。
21.上述铁死亡诱导剂药物可以选自erastin、柳氮磺胺吡啶、谷氨酸盐、rsl3、dp17。例如，所述铁死亡诱导剂药物为rsl3或者erastin。
22.本发明的试剂盒可以用于检测肺腺癌患者肿瘤组织中maff基因的表达水平，判断该患者对铁死亡诱导剂药物处理的敏感性，从而帮助医师选择肺腺癌患者个体化治疗方案、尤其是化疗方案的制定，解决肺腺癌患者对化疗和放疗出现抵抗的问题，实现针对患者的精准医疗。
附图说明
23.图1为用慢病毒过表达maff后a549细胞maff的mrna(左)和蛋白(右)表达水平改变。其中gapdh为内参基因和蛋白。***代表p值显著(小于0.01)。
24.图2为过表达maff的a549细胞与正常a549细胞(对照组)分别接受两种铁死亡诱导剂药物(rsl3和erastin)处理后细胞毒性曲线。a549细胞中，过表达maff之后，相同浓度下铁死亡诱导剂药物对细胞的杀伤作用明显增强，治疗敏感性增加。***代表p值显著(小于0.01)。
25.图3显示了过表达maff的a549细胞和对照细胞用铁死亡诱导剂处理后细胞内的脂质过氧化水平。图中，纵坐标是细胞计数值，横坐标是fitc-a(通过流式细胞仪的fitc通道(绿色荧光)检测的细胞内和细胞膜中的活性氧)，代表细胞脂质过氧化水平。a549细胞中，过表达maff之后，细胞脂质过氧化水平增高，即表明过表达maff促进细胞发生铁死亡。
26.图4显示了过表达maff的a549细胞和对照细胞中内线粒体结构的照片。a549细胞中，过表达maff之后，透射电镜超微结构显示细胞内线粒体形态改变，表明过表达maff促进细胞发生铁死亡。
具体实施方式
27.表达水平随着肺腺癌发生和病程进展明显发生变化(上调表达或者下调表达)的蛋白质或基因有很多种类，我们根据生物信息学对这些蛋白质或基因进行了广泛筛选，重
点考察的对象包括anln、aspm、cdca4、chi3l1、errfi1、furin、golga8a、itga6、jag1、lrp12、maff、masp2、mrps17、nob1、plk1、pnp、ppp1r13l、prkca、pttg1、pygb、riok2、rpp25、scpep1、slc7a11、slc46a3、snx7、tpbg、xbp1等。意外地发现maff基因(nm_012323.4)在肿瘤组织中的表达显著提高，经实验证实了其可以作为诊断肺腺癌铁死亡敏感性的生物标志物。
28.maff即maf f是鸟类肌腱膜纤维瘤病毒(avian musculoaponeurot-ic fibrosarcoma virus，maf)癌基因编码的蛋白质家族中的一员，属于转录因子，但是不包含转录活性结构域(属于小maf蛋白)只能和含b-zip基序的蛋白质结合作为伴侣蛋白促进基因的转录，在细胞内过量表达的话也可以自身形成同源二聚体作为转录的抑制者，抑制基因转录。maf f在抗肿瘤、神经保护、抗炎性反应等方面具有广泛的细胞保护功能。
29.maff作为一种转录因子，在肺腺癌发生发展中起着重要的作用。我们研究发现，maff可以增加肺腺癌细胞对铁死亡诱导剂药物对细胞的杀伤作用。具体地，其可以提高细胞内脂质过氧化水平、改变线粒体形态即削弱其功能，促进了肺腺癌细胞对铁死亡诱导剂的治疗敏感性。结果表明，检测肺腺癌患者肿瘤组织中maff基因的表达，可以有效地在治疗前和治疗过程中，判断患者对铁死亡诱导剂药物的敏感性，解决肺腺癌患者对化疗和放疗出现抵抗的问题，可以有效应用于肺腺癌患者个体化治疗方案的制定，实现针对患者的精准医疗。
30.在本文中，为了描述简便，有时会将某种蛋白比如maf与其编码基因(dna)名称混用，本领域技术人员应能理解它们在不同描述场合表示不同的物质，可以根据语境和上下文容易理解它们的含义。
31.本领域技术人员容易理解，本发明的试剂盒中还可包括下述物品中的至少之一：携带工具，其空间划分为可以收容一种或多种容器、96孔板或板条的限定空间，该容器例如是试剂盒、药瓶、试管、和类似物，每样容器都含有一个单独的用于本发明方法的组分；说明书，其可以写在瓶子、试管和类似物上，或者写在一张单独的纸上，或者在容器的外部或内部，例如是带有操作演示视频app下载窗口比如二维码的纸件，说明书也可以是多媒体的有形或无形形式，比如u盘、网盘等。
32.在对病人的maff基因表达水平进行测定时，本发明试剂盒的检测目标是肺腺癌肿瘤组织中maff的mrna表达量。
33.在用于确定maff的mrna表达量高/低分界标准的数学模型中，ct＝-1/lg(1+ex)*lgx0+lgn/lg(1+ex)，其中，n为扩增反应的循环次数，x0为初始模板量，ex为扩增效率，n为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。
34.起始拷贝数越多，ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代ct值。因此，只要获得未知样品的ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
35.该公式用于本发明时，目的基因就是maff，内参优选为actb(β-actin)。该数学模型中qpcr.ct取13.0为临界值，如果＜13.0，则maff基因高表达，提示患者对铁死亡诱导剂药物治疗敏感；如果≥13.0，则maff基因低表达，提示患者对铁死亡诱导剂药物治疗不敏感，或者出现治疗抵抗。应理解，当内参基因是其它内参基因比如gapdh、18srna时，qpcr.ct临界值及高/低分界标准需要作出适当改变。
36.铁死亡诱导剂药物属于化疗药物，铁死亡诱导剂主要有两大类：第一类包括
erastin、柳氮磺胺吡啶、谷氨酸盐等，可通过system xc-发挥作用；第二类包括rsl3、dp17等，可直接抑制谷胱甘肽过氧化物酶(gpx)活性起作用。其中，erastin与其他铁死亡诱导剂通常介导单一通路不同，它可以介导多种分子，而且作用效果高效、迅速、持久。目前常用的铁死亡诱导剂主要有rsl3、erastin等。
37.铁死亡(ferroptosis)最早是2012年由brent r.stockwell提出的，研究发现erastin可以特异性诱导ras突变细胞死亡，但是没有典型的细胞凋亡特征，铁螯合剂可以抑制这一过程；并且另一种化合物rsl3也有类似的细胞死亡表型。铁死亡是依赖铁离子及活性氧诱导脂质过氧化导致的调节性细胞坏死，其在形态学、生物学及基因水平上均明显不同于凋亡、坏死、自噬等其他形式的调节性细胞坏死。铁死亡的两大特征是铁离子累积、脂质过氧化。
38.与经典的细胞凋亡不同，铁死亡过程中没有细胞皱缩，染色质凝集等现象，但会出现线粒体皱缩，脂质过氧化增加。
39.铁死亡相关特征包括如下几个方面：1.形态学特征：超微结构显示，铁死亡时细胞膜断裂和出泡，线粒体萎缩、线粒体脊减少甚至消失、膜密度增加、细胞核形态正常，但缺乏染色质凝集；电镜下观察到胞内线粒体变小、双层膜密度增高。2.生物学特征：活性氧(ros)增加、铁离子聚集，激活丝裂原活化蛋白激酶(mapk)系统，通过降低胱氨酸的摄取、耗竭谷胱甘肽，抑制ystemxc-和增加还原型酰腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，释放花生四烯酸等介质。3.免疫学特征为损伤相关分子模式(damage-associatedmolecular patterns molecules，damps)释放前炎症介质(如高迁移率族蛋白b1等)。4.基因水平：主要受核糖体蛋白l8(ribosomalprotein l8，rpl8)，铁反应元件结合蛋白(ironresponse element binding protein 2，ireb2)，atp合成酶f0复合体亚基c3(atp synthase f0 complex subunit c3，atp5g3)，三四肽重复结构域35(tetratricopeptide repeat domain 35，ttc35)，柠檬酸合成酶(citratesynthase，cs)，酰基辅酶a合成酶家族成员2(acyl-coasynthetase family member 2，acsf2)以及受代谢、储存基因tfrc、iscu、fth1、ftl、slc11a2的调节。
40.铁死亡的实质是，细胞内脂质氧化物代谢障碍，在铁离子催化作用下代谢发生异常，当细胞抗氧化能力减弱，脂质活性氧堆积，使细胞内氧化还原失衡，诱导细胞死亡。
41.在铁死亡与肿瘤之间关系的研究成为近几年的热点之一。通过提高erastin衍生物的溶解度、分离度以及效价，其中的某些衍生物在异种移植肿瘤中已经初见成效。纳米颗粒诱导铁死亡也在异种移植研究中得到了证实。肿瘤抑癌基因p53能抑制slc7a11(systemxc-的组成部分)，在某些情况下也能够诱导铁死亡的发生；核转录因子nrf2能抑制肝细胞癌中铁死亡的发生；抑制nrf2的表达能增强细胞铁死亡。
42.细胞的脂质过氧化程度能够在一个方面反映细胞铁死亡水平，通过结合细胞中线粒体结构改变与否，基本可以判断铁死亡水平。
43.通过使用本发明的试剂盒检测maff基因表达，与内参基因比如actb相比较，计算maff进行定量pcr的ct值与内参的ct值之差，可以判断患者对铁死亡诱导剂药物敏感性，有效指导肺腺癌患者尤其是出现治疗抵抗患者的个体化治疗，提高临床获益，同时避免不必要的医疗资源浪费。
44.作为上述数学模型的具体应用方式，其允许以计算机软件(计算机程序)形式被输
入基因检测设备比如基因测序仪的信息处理模块、或者被输入或者被输入pcr仪的信息处理模块。而且，上述数学模型还允许以计算机软件(计算机程序)形式被输入智能医疗系统、或者被输入医生的电脑中，帮助医生判断患者是否对铁死亡诱导剂药物敏感，实施相应的临床治疗方案。
45.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于举例说明目的，而不是对本发明的限制。
46.本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
47.实施例
48.实施例中所用的mrna提取分离系统是天根生化科技(北京)有限公司的trnzol universal总rna提取试剂(dp424)，mrna逆转录系统可以是翌圣生物科技(上海)股份有限公司的ii 1st strand cdna synthesis supermix for qpcr(gdna digester plus)试剂。maff基因qpcr试剂是翌圣生物科技(上海)股份有限公司的qpcr sybr green master mix(low rox plus)。
49.按试剂盒说明书操作。引物由生工生物科技(上海)股份有限公司合成提供。
50.人肺腺癌细胞株a549由复旦大学附属中山医院提供，培养条件：在含10％fbs、1％双抗的dmem(高糖)培养基(江苏凯基生物技术股份有限公司)中，于37℃、5％co2培养箱(美国thermo fisher scientific公司)中培养。
51.脂质过氧化实验中荧光标记试剂盒是thermofisherscientific公司的bodipy
tm
581/591c11(脂质过氧化传感器)试剂盒(d3861)d3861，检测仪器为bd ariaiii(355)流式细胞分选仪。
52.所涉及的体外3d培养中培养板为thermofisherscientific公司的96孔圆形(u)底板sphera低黏附表面(货号：174925)。
53.实施例1：在肺腺癌细胞过表达maff
54.慢病毒(lentivirus)载体是以人类免疫缺陷病毒(hiv)为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，可以在体内较长期的表达且安全性高。为了能够在肺腺癌细胞中提高maff基因的表达水平，我们首先获取并合成了maff的蛋白质编码区(cds)区碱基序列(ncbi：nm_012323.4)，并将其克隆构建在吉凯基因公司工具载体(编号gv208)上。随后我们采用吉凯基因公司构建的慢病毒载体系统(包含前述gv慢病毒载体、phelper 1.0载体和phelper 2.0载体三质粒)将扩增和抽提后的慢病毒载体质粒连同两种phelper质粒转入293t细胞进行慢病毒包装，转染后48小时收集细胞上清液进行慢病毒的浓缩与纯化。最后我们将纯化后的慢病毒连同对照病毒转染肺腺癌a549细胞系构建过表达maff的a549稳转细胞株，并用实时荧光定量pcr和western blot的方法检测过表达效果。实验结果如图1所示。研究发现，过表达maff的a549细胞中，maff基因的mrna和蛋白表达水平比对照组显著增加，说明maff基因在a549细胞中被成功过表达。
55.实施例2：肺腺癌细胞过表达maff后铁死亡诱导剂对肿瘤杀伤作用增加
56.我们分别用两种铁死亡诱导剂rsl3和erastin对过表达maff的细胞和对照细胞进行处理。处理48h后采用阿尔玛蓝检测细胞活力。实验结果如图2所示。研究发现与对照组相比，过表达maff的a549细胞对两种铁死亡诱导剂治疗的敏感性都显著上升。由此可推断，在
maff表达水平增高后，铁死亡诱导剂对肿瘤细胞的杀伤作用明显增强，治疗的敏感性增加。
57.实施例3：肺腺癌细胞过表达maff后铁死亡诱导剂诱导细胞铁死亡程度增加
58.我们进一步检测了铁死亡诱导剂rsl3(浓度1um)作用下，过表达maff后a549细胞内脂质过氧化水平。实验结果如图3和图4所示。研究发现，在rsl3药物作用6小时后，过表达maff的a549细胞脂质过氧化程度比对照组细胞高。同时，我们对rsl3药物处理后的过表达maff的细胞和对照细胞进行细胞内线粒体结构拍摄，实验结果如图3所示。研究发现，与对照组细胞相比，过表达maff的a549细胞线粒体膜结构模糊。以上两项结果均表明maff可以提高铁死亡诱导剂促进的细胞铁死亡水平。
59.实施例4：肺腺癌患者组织中maff表达和铁死亡诱导剂药物治疗效果
60.我们进一步收集了50例在术后接受一线铂类加培美曲塞的联合化疗方案和/或放疗治疗的iiia期肺腺癌肿瘤患者组织(患者未接受除放化疗之外的其他术后辅助治疗方案)。我们分别检测了这50例原肿瘤组织样本中maff的mrna表达水平，并分别分离了样本中的肿瘤细胞，将其接种至96孔板(1000个细胞/孔)进行3d培养。待培养三天后对每个肿瘤球状体使用rsl3药物(浓度1um)处理48小时。通过对比原肿瘤组织中maff的表达水平和治疗前后体外3d肿瘤球状体的体积改变，来初步判断本试剂盒的在判断铁死亡诱导剂治疗疗效中的潜在效果。
61.我们通过实时定量pcr检测了肺腺癌患者接受放化疗后在经受两种铁死亡诱导剂rsl3和erastin处理前后maff基因的mrna表达水平，根据maff基因表达量变化统计，总结出如下规律：
62.以actb基因为内参，maff基因的mrna表达量表示为qpcr.ct＝qpcr.ct.maff-qpcr.ct.actb，如果qpcr.ct＜13.0，则maff基因高表达，患者对铁死亡诱导剂药物治疗敏感；如果qpcr.ct≥13.0，则maff基因低表达，患者对铁死亡诱导剂药物治疗不敏感。
63.在这50例样本中其中20例在体外3d培养并用rsl3药物处理后体积缩小50％以上，30例体积缩小不超过50％(样本均来自复旦大学附属中山医院胸外科)。定量pcr方法结果表明，rsl3药物处理后体积缩小50％以上的20例样本中有17例患者的qpcr.ct小于13.0，认为maff高表达；而体积缩小不超过50％的30例样本中仅有6例的qpcr.ct小于13.0。因此初步判断本试剂盒的灵敏度为85％，特异性为80％。
64.上述研究结果，本发明发现了maff基因表达水平可以用于评估肺腺癌患者对铁死亡诱导剂药物处理的敏感性，有助于为其制定精准的治疗方案。应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域的技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明的范围。