NADC34-like猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量PCR检测试剂盒的制作方法

nadc34-like猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量pcr检测试剂盒
技术领域
1.本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及nadc34-like猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量pcr检测试剂盒。


背景技术：

2.猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，prrsv)是引起猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，prrs)的病原。prrsv有两种基因型，即prrsv-1(欧洲型)和prrsv-2(北美型)。近年来，我国prrsv流行趋势日渐严重，新的基因型和重组病毒不断出现，导致基因型愈发复杂，威胁我国养猪业的健康发展。
3.以orf5基因的遗传演化分析划分，基因prrsv-2可分为9个系，在国内存在1、3、5、8和9系，1系包括1.1～1.9的9个亚系。2012年后，nadc30-like prrsv(1.8亚系)在我国出现。到2016年，nadc30-like prrsv在我国多个地方取代了高致病性prrsv，并成为了主要流行株。2017年，nadc34-like prrsv(1.5亚系)在我国辽宁省被发现。随后国内多个省份相继报道了nadc34-like prrsv的流行。通过对比nadc30-like prrsv和nadc34-like prrsv的分支情况、nsp2的缺失模式、病毒的早期重组模式等，发现nadc30-like prrsv和nadc34-like prrsv相似，nadc34-like prrsv很可能与本地病毒发生重组，极有可能像nadc30-like prrsv一样，出现大范围的流行。
4.nadc34-like prrsv主要特征为nsp2蛋白上存在100aa的连续缺失，同时orf5基因的限制性片段长度多态性(rflp)具有1-7-4模式。nadc34-like prrsv对我国猪场造成严重的猪只发病和死亡，同时，对多个国家的养猪业造成了巨大的影响。鉴于nadc34-like prrsv对养猪业造成的危害，我们需要加大监测力度，及时采取相应的对策，防控该类毒株在我国的流行。现有的prrsv检测方法中还没有用于鉴别nadc34-like prrsv的荧光定量pcr检测方法，而由于毒株上的区别，nadc30-like prrsv的检测手段则不适用于检测nadc34-like prrsv，因此建立nadc34-like prrsv的荧光定量pcr检测方法对于nadc34-like prrsv的及时监测和疫病防控具有重要意义。


技术实现要素：

5.有鉴于此，针对背景技术中指出的问题，本发明提供nadc34-like猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量pcr检测试剂盒，该试剂盒可以快速、特异的对nadc34-like prrsv进行扩增、诊断。
6.为达到以上技术目的，本技术采用的技术方案如下：
7.第一方面，本发明提供nadc34-like猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量pcr检测引物与探针，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物和所述下游引物的序列分别如seq id no:1和seq id no:2所示，所述探针序列如seq id no:3所示。
8.优选地，所述探针的3’端结合荧光淬灭基团，5’端结合荧光报告基团。
9.更优选地，所述探针的荧光淬灭基团为tamra，荧光报告基团为fam。
10.第二方面，本发明提供nadc34-like猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量pcr检测试剂盒，包括上述引物和探针。
11.进一步地，所述试剂盒包括核酸提取单元、核酸反转录单元和核酸扩增单元；其中，所述核酸提取单元包括用于病毒核酸提取的试剂；所述核酸反转录单元包括用于对提取的病毒核酸进行反转录的试剂；所述核酸扩增单元包括用于以反转录核酸为模板进行pcr扩增的试剂、上述引物和探针。
12.第三方面，本发明提供上述检测试剂盒非诊断治疗目的地从猪繁殖与呼吸综合征病毒中鉴别nadc30-like prrsv的方法。
13.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明nadc34-like prrsv的荧光定量pcr检测引物、探针和试剂盒，该引物和探针是从多组设计的引物和探针中最终筛选获得，具有较高的特异性和灵敏度，且能够准确、快速鉴定nadc34-like prrsv，38分钟左右即可完成荧光定量pcr检测，且操作简单、实用。
附图说明
14.图1为实施例1中引物和探针筛选结果。
15.图2为实施例2中利用检测试剂盒对nadc34-like prrsv的特异性检测结果，其中曲线1为nadc34-like prrsv阳性样品的扩增曲线；曲线2～13分别为淋巴结、肺组织、1640培养基、nadc30-like prrsv、qyyz-like prrsv、hp-like prrsv、resp prrsv mlv like prrsv、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒的扩增曲线。
16.图3为实施例3中利用检测试剂盒对nadc34-like prrsv的灵敏度检测结果，曲线1～8分别代表的拷贝数分别为1.56
×
108、1.56
×
107、1.56
×
106、1.56
×
105、1.56
×
104、1.56
×
103、1.56
×
102、1.56
×
101copies/μl。
具体实施方式
17.在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
18.下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
19.实施例1
20.引物和探针的筛选：
21.通过对比nadc30-like prrsv、qyyz-like prrsv、hp-like prrsv、resp prrsv mlv like prrsv与nadc34-like prrsv的gp5基因序列，设计了多组引物和探针，具体序列如下：
22.1号：
23.forward primer:ccaarggcaaacyctatc(seq id no:1)
24.reverse primer:cctycgacctcarcttta(seq id no:2)
25.probe:cccttthtctaygatnacrggag(seq id no:3)
26.2号：
27.forward primer:ctgttttgttgcgctcgtca(seq id no:4)
28.reverse primer:gtkagggcgccatrggagac(seq id no:5)
29.probe:gccagcaacarcagcagctc(seq id no:6)
30.3号：
31.forward primer:ctgttgctcgcaattgcctt(seq id no:7)
32.reverse primer:gtctcmacygcccartcaaa(seq id no:8)
33.probe:tgttgcgctcgtcaacgcca(seq id no:9)
34.4号：
35.forward primer:tttgaytgggcrgtkgagac(seq id no:10)
36.reverse primer:caggccractgtgtcragga(seq id no:11)
37.probe:gcgccctmaccaccagccat(seq id no:12)
38.5号：
39.forward primer:ctctatcgttggcggtctcc(seq id no:13)
40.reverse primer:cttraggtcgatsaggtgrc(seq id no:14)
41.probe:agaaagggggyaaagttgaggtcga(seq id no:15)
42.将设计的多组引物和探针进行荧光定量pcr扩增，具体的荧光定量pcr方法为：
43.1)待检样品rna提取：将200μl含有nadc34-like prrsv毒株的细胞培养液(1640培养基cat no.c11875500bt)，使用axyprep体液病毒dna/rna小量试剂盒(cat no.ap-mn-bf-vna-250)提取模板rna，-70℃保存。
44.所采用的nadc34-like prrsv毒株与ia/2014/nadc34(mf326985.1)同源性达到99％，是从辽宁省某已经被诊断为nadc34-like prrsv感染的发病猪场获得，本发明在获得nadc34-like prrsv毒株后对其进行验证：以该nadc34-like prrsv毒株的cdna为模板，进行pcr扩增并测序，得到的序列与ncbi中已发表的nadc34-like prrsv(genbank:mz820388.1)序列同源性达到99％，确定为已知的nadc34-like prrsv毒株。
45.2)反转录体系及过程：使用primescript
tm rt master mix(perfect real time)(takara code:rr036q)反转录试剂盒，反应体系为20μl体系，具体如下操作：16μl的rna与4μlrt预混液混匀，37℃反应15min，然后迅速置于冰上2min，反转录产物保存于-20℃，作为后续实验的模板。
46.3)定量pcr反应体系：使用thunderbird probe qpcr mix(code no.qps-101,qps-101t)定量pcr试剂盒，反应体系为20μl体系，具体如下表1：
47.表1 定量pcr反应体系
48.序号组分体积1thunderbird probe qpcr mix10μl2forward primer(20μm)0.2ul3reverse primer(20μm)0.2ul4probe0.1ul
550
×
rox reference dye0.04μl6模板2ul7rnasefreeh2o补足至20μl
49.扩增条件：将上述pcr体系置于abi公司7500fast定量pcr仪上进行扩增反应，扩增条件为：95℃，预变性20s；95℃，3s，60℃，40s，共40个循环。
50.最终的定量pcr结果如图1所示，显然，1号引物和探针的结果最好，因此，将其作为本发明检测nadc34-like prrsv的引物和探针，并开展后续的相关实验。
51.实施例2
52.特异性检验
53.采用实施例1筛选获得的最优引物和探针(实施例1中第1组)进行荧光定量pcr扩增，通过扩增曲线快速、准确的鉴别nadc34-like prrsv。具体的荧光定量pcr方法为：
54.1)待检样品rna提取：200μl含有nadc34-like prrsv毒株的1640细胞培养液(nadc34-like prrsv毒株来源同实施例1)、100mg的淋巴结病料和100mg肺组织病料(病料从辽宁省猪场异常猪只中分离，未知是否感染病毒)以及1640细胞培养基(不含nadc34-like prrsv，为阴性对照)作为待检样品，使用axyprep体液病毒dna/rna小量试剂盒(cat no.ap-mn-bf-vna-250)提取模板rna，-70℃保存。
55.2)反转录体系及过程参照实施例1。
56.3)定量pcr反应体系参照实施例1。
57.4)nadc30-like prrsv、qyyz-like prrsv、hp-like prrsv、resp prrsv mlv likeprrsv、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒的培养液以同样的方式进行检测。
58.5)结果判定：有扩增曲线出现且ct值小于35的即是阳性样品。其中扩增曲线ct值小于35的判断为阳性，ct值大于35的超出本方法灵敏度，判为阴性。检测结果见表2、图1和图2。结果表明除nadc34-like prrsv感染的阳性细胞外均没有扩增曲线，特异性良好。
59.表2 待检样品检测结果
[0060][0061]
实施例3
[0062]
灵敏度检验
[0063]
以实施例2中nadc34-like prrsv毒株的cdna为模板，以seq id no:1～2为引物，seq id no:3为探针，按照实施例2所述的荧光定量pcr方法进行扩增，得到70bp扩增产物(扩增产物的序列如seq id no:16所示：
[0064]
ccaarggcaaacyctatcgttggcggtctccygtnatcrtagadaaagggggtaaagytgaggtcgragg)，将该扩增产物连接到克隆载体pmd19-t(大连宝生物工程有限公司)制备得到含有gp5基因的标准阳性质粒(pmd-gp5)。经测定，pmd-gp5浓度为1.56
×
109copies/μl。
[0065]
将阳性质粒pmd-gp5用配置的灭菌双蒸水10倍递增稀释作为模板，每个稀释度各取2μl作为模板，按实施例2所述的荧光定量pcr方法进行检测，观察扩增曲线，以出现阳性预期曲线所用模板量的最高稀释度计算其敏感性。检测结果如图3所示，结果表明最小检出量为15.6copies/μl，灵敏度良好。
[0066]
综上，现有的基因芯片技术存在荧光标记不均一，灵敏度低；杂交条件高度个体化，难以形成统一的标准；影响因素多、稳定性差：芯片同时存在不同程度的假阳性，重复性也有差异，这与靶分子浓度、探针浓度、杂交双方的序列组成、盐浓度及温度等对杂交的动力学存在影响有关；制作程序复杂，样品处理繁琐，成本高：需要昂贵的仪器，如光刻机器、寡核苷酸合成仪和激光共聚焦显微镜等设备来共同完成(王晓薇,等.2015.基因芯片在现代畜牧业的应用研究进展.现代畜牧兽医12:4.)。样品制备和待测定靶标探针标记方法复
杂，需专项技术人员才能操作，增加了成本，对于现今prrsv及时监测的需求，基因芯片技术从各个方面都无法满足和普及。
[0067]
而本发明nadc34-like prrsv的荧光定量pcr检测引物、探针和试剂盒，该引物和探针特异性和灵敏度都较高，且能够鉴定nadc34-like prrsv，可以对各种临床样品进行检测，从而可以快捷地对nadc34-like prrsv进行诊断，操作简单、实用。现有的prrsv检测方法中还没有用于鉴别nadc34-like prrsv的荧光定量pcr检测方法，因此建立nadc34-likeprrsv的荧光定量pcr检测方法对于nadc34-like prrsv的及时监测和疫病防控具有重要意义。
[0068]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。