一种用于装载DNA纳米球的无危险品组分试剂的制作方法

本发明涉及生物，具体涉及一种用于装载dna纳米球的无危险品组分试剂。

背景技术：

1、随着生物技术的发展和社会认知度的提高，高通量基因测序已广泛应用于科学研究、精准医学、社会卫生和公共安全等的各个领域。华大智造是国产基因测序仪制造行业的集大成者，其不同平台应用的高通量测序技术都基于dna纳米球(dnb)及联合探针锚定聚合技术(cpas)，使用dnb作为测序单元。在进行测序之前需要将dnb精准且单一地装载到测序载片的修饰点位上。对于滚环扩增获得的dnb，其类似于具有相同dna单链多个拷贝的纳米级球体，在溶液中的状态类似一团缠绕起来的毛线球，在无处理的情况下，当其与带有荧光修饰的dntps结合后，单个dnb受激发后的荧光信号相对分散，影响测序准确度。除此之外，dnb与测序载片的结合不够紧密，受到试剂泵入产生的流体动力冲刷，会难以保持形态，变得松散，造成测序质量明显下降。因此，dnb是否可以稳固且紧凑的装载到载片上对后续测序的质量有至关重要的影响。

2、为了解决dnb本身结构不够紧凑、与测序载片结合不够稳定的问题，实现dnb测序的高稳定性和可靠性。对于华大智造各测序平台，会将制备完成的dnb首先加载到测序载片表面进行初结合，其后通过注射泵将各种试剂以一定的顺序泵入载片表面，与载片表面的dnb发生不同反应，最终使其与测序载片紧密吸附并保持稳定可重复测序形态，这一过程称之为“post-load”。

3、dnb crash buffer(dcb)是“post-load”过程中使用的重要试剂之一，如图1所示，其可以通过与dnb争夺水分子并促使dna缩合的作用使已经加载到载片上的dnb变得紧实，并在与其他试剂的共同作用下稳定的锚定到载片上，使dnb在测序过程中不会因各种试剂的冲刷而变形，维持dnb在各种生化反应过程中的形态稳定性，并使荧光信号变得集中以提高测序质量。

4、dnb crash buffer(dcb)试剂在post load过程中使用较多，其主要成分为高浓度的异丙醇和peg4000，dcb试剂对于dnb的作用原理是dna失水凝聚产生的缩合效应。

5、可以理解，dcb试剂对于以dnb为测序单元的各种测序平台是不可或缺的。然而目前普遍使用的dcb，其配方中具有高浓度的异丙醇(isopropanol，ipa)，属第三类危险化学品。异丙醇具有毒性，饮用会造成晕眩、恶心、呕吐等症状，大量食用会造成意识丧失甚至死亡。其闪点低至12℃，易燃，蒸汽会与空气形成易爆混合物，遇明火会引起燃烧爆炸，遇氧化剂会产生剧烈反应，需遵照危化品管理规范进行保存及使用。因此含有高浓度异丙醇的dcb试剂具有一定的使用风险，需要低温保存，远离火种、热源，并且在运输尤其是航空运输上受到严重限制，需采用专门的危化品包装箱，并选择特定航班，影响试剂出口，增加了运输成本。除此之外，含有异丙醇的dcb试剂具有一定的环境污染性，需以危险废弃物对废弃试剂处理，增加了环保负担和人力成本。常规dcb试剂配方中异丙醇可产生的效果，类似试剂如甲醇、乙醇、丙酮、乙腈等也会有良好效果，当然这些均属危险品。

6、因此，如果能提供不含有危险品成分的dcb试剂替代方案将具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种不含有危险品成分的dcb试剂替代方案，可以替代异丙醇主成分dcb进行post-load，有效的实现dnb在测序载片的锚定和结构稳定，确保获得高质量的测序数据。

2、第一方面，本发明要求保护一种用于装载dna纳米球的试剂。

3、本发明所要求保护的用于装载dna纳米球的试剂，是在dna纳米球测序的post-load过程中发挥作用，不含有异丙醇或其他低闪点危险品试剂，其有效成分为如下任一：

4、(a1)醋酸钠、乙二醇和peg4000；

5、(a2)乙二醇、peg4000、亚精胺和氯化钠；

6、(a3)乙二醇和peg4000；

7、(a4)具有吸湿性的有机试剂和阳离子组合。

8、所述具有吸湿性的有机试剂可为二乙二醇、三乙二醇等。所述阳离子可为多价阳离子化合物如四氯化六胺合钴或多阳离子聚合物等。

9、在(a1)中，所述试剂偏酸性(如ph为5.2-7，不含端点值)，醋酸钠在所述试剂中的终浓度可为30-450mm(如300mm)，乙二醇在所述试剂中的体积百分含量可为20-70％(如65％)，peg4000在所述试剂中的终浓度可为20-100g/l(如75g/l)。

10、在(a2)中，乙二醇在所述试剂中的体积百分含量可为20-75％(如60％)，peg4000在所述试剂中的终浓度可为20-120g/l(如100g/l)，亚精胺在所述试剂中的终浓度可为10-500μm(如50μm)，氯化钠在所述试剂中的终浓度可为1-100mm(如2mm)。

11、在(a3)中，乙二醇在所述试剂中的体积百分含量可为20-80％(如65％)，peg4000在所述试剂中的终浓度可为20-100g/l(如75g/l)。

12、在本发明的一些案例中，(a1)中所述试剂组成如下：体积百分含量为10％的ph5.2的3m醋酸钠、体积百分含量为65％的乙二醇、终浓度为75g/l的peg4000，余量为水。

13、在本发明的一些案例中，(a2)中所述试剂组成如下：体积百分含量为60％的乙二醇、终浓度为100g/l的peg4000，终浓度为50μm的亚精胺，终浓度为2mm的氯化钠，余量为水。

14、在本发明的一些案例中，(a3)中所述试剂组成如下：体积百分含量为65％的乙二醇、终浓度为75g/l的peg4000，余量为水。

15、第二方面，本发明要求保护一种在以dna纳米球为测序单元的测序过程中将dna纳米球装载到测序载片上的方法。

16、本发明要求保护的在以dna纳米球为测序单元的测序过程中将dna纳米球装载到测序载片上的方法，可包括如下步骤：将测序载片置于测序仓内，用前文第一方面中所述试剂处理。

17、进一步地，对于本发明最佳dcb配方(即前文第一方面中的(a1))，其处理时间比常规dcb延长了30s。常规dcb处理与dnb的作用时间约为120s，因此总反应时间为150s。

18、第三方面，本发明要求保护如下任一用途：

19、(b1)前文第一方面中所述试剂在将dna纳米球装载到测序载片上的用途；

20、(b2)前文第一方面中所述试剂在使dna失水缩合中的用途；

21、(b3)前文第一方面中所述试剂在以dna纳米球为测序单元的测序中的用途；

22、(b4)前文第二方面中所述方法在以dna纳米球为测序单元的测序中的用途。

23、在第二方面和第三方面中，所述以dna纳米球为测序单元的测序的平台为mgiseq-2000或dnbseq-t20×2。所述测序如se100、pe100、pe50等。

24、在实际应用中，需使用本发明的替代试剂方案(即前文第一方面所述试剂)替换mgiseq-2000测序试剂槽或dnbseq-t20×2加载试剂槽中的常规异丙醇dcb试剂。同时，在原dcb试剂泵入后额外增加30s的试剂作用时间(作用总时长150s)。

25、本发明所提供的新的dcb配方包含吸水性强、闪点高且低毒的醇类溶剂乙二醇，一定浓度及酸碱值的醋酸钠溶液及peg4000，在此三种成分的综合作用并给予一定反应时间的基础上，可以起到近似于以异丙醇为主成分的dcb试剂的效果，使测序载片表面的dnb失水变得紧实，实现dnb与测序载片的稳固结合，不易因多种试剂的冲刷而变形或脱离载片吸附位点。

26、为使本发明试剂配方的作用原理易于理解，此处对各成分起到的作用进行说明。在本替代dcb体系中，钠离子会均匀结合到dna分子表面，使dna骨架带负电荷的磷酸基团与体系中高浓度的钠离子结合，从而减少dna分子之间同性电荷的排斥，使其易于聚合。高浓度的乙二醇替代异丙醇作为溶剂，更温和的作用使dnb缓慢失水，因此需要给予一定的孵育时间，另外本配方中的peg4000可诱导水溶液中的大分子的聚集，可以实现按分子大小选择性沉淀dna，因dnb分子量较大，此体系中使用peg4000浓度较低。另外，dcb溶液保持酸性条件可以使测序载片表面带正电荷，在整个dcb作用过程中维持对对较强的电荷吸附力，以助dnb更好的坐沉在载片上。

27、本发明的主要原理在于dna缩合，其应用与多个领域直接相关，因此本发明中涉及到的各类替代配方和试剂可以以一定组合应用在其他领域，包括细胞生物学、病毒学和用于治疗目的的基因传递。此外，因dna分子从溶液中塌缩成定义明确的粒子是聚合物相变的一个很好的例子，所以dna缩合也涉及到高分子物理学研究。

28、本发明提供了一种新的dcb配方，将dcb试剂中的异丙醇成分完全去除，变更为更安全的非危险化学品，可作为替代dcb试剂在dnb测序中必不可少的post-load中发挥作用，解决因危险化学品的存在而引起的安全、运输和管理问题，提高了安全性并降低了成本。