一种牛传染性鼻气管炎病毒gD单克隆抗体、检测试剂盒和应用的制作方法

本发明涉及生物，具体涉及一种牛传染性鼻气管炎病毒gd单克隆抗体、检测试剂盒和应用。

背景技术：

1、牛传染性鼻气管炎（infectious bovine rhinotracheitis, ibr）是由牛传染性鼻气管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，ibrv）或牛疱疹病毒i型（bovine herpesvirus 1，bhv-ⅰ）引起的一种牛呼吸道接触性传染病，临床表现形式以呼吸道为主，伴有结膜炎、流产、乳腺炎，有时诱发小牛脑炎等。

2、ibrv属疱疹病毒科a疱疹病毒亚科，该病毒呈球形，带囊膜，成熟病毒粒子的直径约150～220 nm，主要由核心、衣壳和囊膜三部分组成，其dna具有两种异构体。ibrv基因组可编码大约70个蛋白质，其结构和功能目前大部分已知，存在于病毒囊膜的gb、gc、gd和ge四个主要精蛋白基因已经测序并在哺乳动物中表达。gb在哺乳动物细胞中的表达显示出引起细胞融合和多核体的形成，对病毒复制是必需的；gc对病毒吸附组织培养细胞是重要的，但它在牛细胞内的表达并不影响病毒蚀斑的数量和病毒的存在；gd被认为是病毒粒子表面和病毒感染细胞的主要分子，抗体糖蛋白的单克隆抗体在病毒吸附后中和病毒并显示出较高的中和滴度，表明gd可能参与病毒进入细胞，并为病毒复制非必需基因。鼠和牛的免疫试验显示出gd能够引起比gb、gc更强和持久的细胞免疫。

3、牛传染性鼻气管炎病毒或牛疱疹病毒i型最外层的囊膜包含11种糖蛋白，其中gb、gc和gd糖蛋白具有高免疫原性，是机体免疫细胞识别病毒粒子的主要靶蛋白，能够刺激机体产生抗体并在补体存在下致使感染细胞裂解。其中，gd蛋白对病毒的复制时必须的，是疱疹病毒科病毒粒子结构蛋白中最保守的蛋白。

4、通过检测gd蛋白抗体而检测动物是否受ibrv感染的风险等级。血清学检测方法可采用中和试验、酶联免疫吸附试验（elisa）等方法。而elisa方法无需病毒培养、耗时短、操作简便、适用性广等特点常用于抗体监测。

技术实现思路

1、为此，本发明提供一种牛传染性鼻气管炎病毒gd单克隆抗体、检测试剂盒和应用，建立阻断elisa抗体检测方法以解决ibrv病毒抗体检测中灵敏度低、特异性低等问题。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、根据本发明的第一方面提供一种牛传染性鼻气管炎病毒gd单克隆抗体，所述牛传染性鼻气管炎病毒gd单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列如seq id no：1所示，重链可变区氨基酸序列如seq id no：2所示。

4、所述seq id no：1的序列如下：

5、dielsqspaitsaslgerqnmtrspgtrlrasthhwyqqyegsspklwihcdwdmptrvparfsgsgsgtsrfltigsmehrdaatykyvdkdygtacafgaglssrsn。

6、所述seq id no：2的序列如下：

7、qvflpesgpggvkpsqdlsltcyvtgysikshnvrkirqfphgklewmghvgypdgptyslslssrisitkltsqnqfflfcnsvttedtdyycarstmlptrrvgyvdqgttvtvhs。

8、进一步的，所述轻链可变区氨基酸序列由轻链可变区的核苷酸序列编码而成，如seq id no：3所示；

9、所述重链可变区氨基酸序列由重链可变区的核苷酸序列编码而成，如seq id no：4所示。

10、所述seq id no：3的序列如下：

11、gacatcgagctgagccagagccccgccatcaccagcgccagcctgggcgagaggcagaacatgaccaggagccccggcaccaggctgagggccagcacccaccactggtaccagcagtacgagggcagcagccccaagctgtggatccactgcgactgggacatgcccaccagggtgcccgccaggttcagcggcagcggcagcggcaccagcaggttcctgaccatcggcagcatggagcacagggacgccgccacctacaagtacgtggacaaggactacggcaccgcctgcgccttcggcgccggcctgagcagcaggagcaac。

12、所述seq id no：4的序列如下：

13、caggtgttcctgcccgagagcggccccggcggcgtgaagcccagccaggacctgagcctgacctgctacgtgaccggctacagcatcaagagccacaacgtgaggaagatcaggcagttcccccacggcaagctggagtggatgggccacgtgggctaccccgacggccccacctacagcctgagcctgagcagcaggatcagcatcaccaagctgaccagccagaaccagttcttcctgttctgcaacagcgtgaccaccgaggacaccgactactactgcgccaggagcaccatgctgcccaccaggagggtgggctacgtggaccagggcaccaccgtgaccgtgcacagc。

14、根据本发明的第二方面提供制备如上述一种牛传染性鼻气管炎病毒gd单克隆抗体的方法，包括pfastbac-htb-gd的载体的构建、bacmid-ibrv gd转染昆虫sf9细胞、重组ibrv gd蛋白的表达与纯化、杂交瘤细胞培养及牛传染性鼻气管炎病毒gd单克隆抗体筛选。

15、根据本发明的第三方面提供如上所述一种牛传染性鼻气管炎病毒gd单克隆抗体在制备ibrv抗体检测试剂盒中的应用。

16、根据本发明的第四方面提供一种ibrv抗体检测试剂盒，包含如上所述的单克隆抗体。

17、本发明的微孔酶标板条中包被昆虫细胞表达的牛传染性鼻气管炎病毒gd抗原，hrp标记的牛传染性鼻气管炎病毒gd单克隆抗体。该检测试剂盒利用了阻断elisa的原理。其原理为：牛血清样本中存在牛传染性鼻气管炎病毒gd的抗体，与酶标板包被的抗原结合阻断特异性hrp标记的牛传染性鼻气管炎病毒gd单克隆抗体与酶标板抗原的结合，抑制了tmb显色，显色强度与血清抗体呈负相关。如果样本中牛血清无ibrv抗体显色最强，结果为阴性；根据显色程度计算阻断率，判定牛血清中牛传染性鼻气管炎病毒gd抗体水平。

18、本发明具有如下优点：

19、我们所研制的牛传染性鼻气管炎病毒gd蛋白阻断elisa抗体检测试剂盒即是通过检测gd蛋白抗体而检测动物是否受ibrv感染的风险等级。

20、本发明用杆状病毒-昆虫细胞表达技术，克隆表达牛传染性鼻气管炎病毒gd蛋白，并以纯化蛋白包被酶标板，在板孔中加入待测血清，孵育后洗板，hrp标记的牛传染性鼻气管炎病毒gd特异性抗体会被牛传染性鼻气管炎病毒gd蛋白捕获，采用阻断elisa方法原理组装牛传染性鼻气管炎病毒gd蛋白阻断elisa抗体检测试剂盒，适合牧场的规模化血清样本检测，操作简便，且灵敏度高、特异性强。

21、本发明通过检测阴、阳性样本及与牛病毒性腹泻毒标准血清、牛口蹄疫标准血清、牛呼吸合胞体病毒标准血清等表明试剂盒的敏感性、特异性良好。

22、本发明利用血清为检测对象，以其中的牛传染性鼻气管炎病毒或牛疱疹病毒i型特异性牛传染性鼻气管炎病毒gd蛋白为检测指标，利用阻断elisa方法，实现了牛传染性鼻气管炎的简便检测和诊断，适用性广，有助于进一步推进我国牛传染性鼻气管炎的净化，提升养殖效益。

23、本发明的单克隆抗体为经杂交瘤技术制备并筛选出的可与牛传染性鼻气管炎病毒gd结合而不与bvdv、fmdv、牛呼吸道合胞体病毒标准血清结合，且与牛传染性鼻气管炎病毒gd结合的亲和性单克隆抗体，利用该单克隆抗体可检测牛血清ibrv疫苗免疫的抗体水平。