一种高纯度釉原蛋白的提取工艺

1.本发明涉及蛋白提取工艺技术领域，具体涉及一种高纯度釉原蛋白的提取工艺。


背景技术：

2.蛋白质是诸多生命活动的功能执行者，其相关研究是生命科学研究的热点之一。其中釉基质蛋白是一类抽提自发育期牙釉的蛋白家族，其组成复杂多样，含有以釉原蛋白家族主的几十种蛋白成分，这些釉原蛋白具有相近的分子链段和亲疏水性。研究发现，釉基质蛋白在牙周再生中显示出多能的治疗效果，是最负盛名的牙周治疗生长因子，在牙周及牙龈再生、根尖封闭、盖髓治疗、种植体周围炎和软组织伤口愈合的治疗方面均取得了良好的临床效果。该产品成本很低(提取自猪下颌骨的未萌发磨牙)，但销售价格昂贵(70毫克售价近500 美元)，基于实证科学发展起来的釉基质蛋白产品，二十年余以来畅销全球多个国家。但尽管釉基质蛋白临床治疗效果显著，其牙周再生的相关机理却至今仍然不清晰且迄今为止。emdogain是齿科巨头士卓曼公司推出的釉基质蛋白类药物，为牙周治疗唯一上市的低免疫原性生物制剂。 emdogain目前在国内没有上市，国内药企也没有出现类似emdogain的基于釉基质蛋白的药物。
3.蛋白质的纯化获得是开展蛋白质结构和功能研究的重要前提。实验过程中，一般使用溶剂抽提的方式将蛋白质从原组织和细胞中以溶解的状态释放出来。而从原料中抽提得到的蛋白质溶液一般蛋白质含量较低，并含有多种杂质，因此抽提液进行初步提取，也称粗提或粗分级，主要目的是除去糖、脂类、核酸及大部分杂蛋白。粗分离操作一般应该尽量简单快速，并且适用于处理大量样品，所以以沉淀法为主，沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程，配合上其他诸如离心过滤等固液分离技术，可以达到快速浓缩分离蛋白的目的。蛋白质沉淀常用的方法有盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、生物碱试剂与某些酸(如三氯乙酸)沉淀等。而沉淀技术，又包括简单沉淀、分级沉淀等。分级沉淀是采用分次加入沉淀剂，使不同的蛋白质在不同沉淀剂浓度下分别沉淀，从而被分离开来的方法。
4.釉基质蛋白的纯化，是困扰众多材料学和口腔研究工作者的难题。一是釉基质蛋白是基于发育期牙釉质抽提而来的天然来源生物药物，具有成分繁杂，批间差异明显，成品质量难以评价等特点。研究发现，emdogain中包含p173、 p161、p148、trap(富酪氨酸釉原蛋白肽)、4.5k、4.3k、3k等诸多釉原蛋白组分，其中最重要的几种蛋白为trap、p148、p173和p161。二是作为釉基质蛋白主要组分的釉原蛋白单体纯化难度大。这导致国内缺乏釉原蛋白单体这一研究材料，难以对釉基质蛋白开展精确的药理药效关系研究，这导致釉基质蛋白牙周再生机理至今仍不清晰，进一步加剧了釉基质蛋白类产品的深度研究开发。
5.目前，从动物的生长发育期牙釉组织中抽提得到粗提釉原蛋白的方案已经十分成熟。而从粗提釉原蛋白中分离纯化天然釉原蛋白组分的研究工作，在国内国外都有进行，主要应用的是凝胶渗透色谱及反相液相色谱结合等多种方法组合的纯化方式。但现有方法普遍都存在所得釉原蛋白产物纯度不高，纯化周期长，样品损失大，纯化过程重复性低，成本高昂等问题。
6.因此，开发一种步骤简单、无需色谱辅助即可得到高纯度釉原蛋白单体的釉基质蛋白纯化方法，对于研发国产的釉基质蛋白类新药具有重要的意义。


技术实现要素：

7.本发明旨在解决釉原蛋白单体难以纯化获得的问题，提供一种高纯度釉原蛋白的提取工艺，该方法步骤简单，可重复性好，纯化效率高，成本较低。
8.为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
9.本发明提供了一种高纯度釉原蛋白的提取工艺，包括以下步骤：
10.s1.提供釉基质蛋白粗提液；
11.s2.向所述釉基质蛋白粗提液中加入三氯乙酸溶液，震荡、孵育，使得沉淀充分析出；其中，釉基质蛋白粗提液中三氯乙酸的浓度1.35％≤c≤1.50％；
12.s3.将孵育后的混合液进行离心，并收集上清液；
13.s4.向收集的上清液中继续加入三氯乙酸溶液，震荡、孵育；待沉淀充分析出后，离心，收集沉淀物，即得到目标釉原蛋白p148。
14.三氯乙酸是一种常见的蛋白沉淀实际，常用于蛋白的粗提取。发明人在前期的研究中发现，三氯乙酸也具备分级沉淀的效果，因此发明人利用三氯乙酸这一性质，对釉基质蛋白进行分级沉淀，最终分离得到了高纯度的釉原蛋白p148。具体的，釉基质蛋白中的几种重要蛋白——trap、p148、p173和p161——在较低浓度的三氯乙酸的存在下都会析出产生沉淀，但是当三氯乙酸的浓度超过某一浓度后，trap、p173和p161的析出量接近为0，而p148仍会有相当量的沉淀析出，因此收集这部分析出的沉淀，即得到高纯度的p148。与现有技术中的釉原蛋白分离纯化方法相比，本发明提供的方法十分简单，无需色谱等辅助手段，既简化了纯化的步骤，又降低了纯化的成本，同时该方法可进行大批量生产高纯度的p148蛋白，产业化前景较好。
15.本发明步骤s1中，釉基质蛋白粗提液既可以采用提取液从牙釉质中提取得到，也可以将粗提釉原蛋白产品溶于有机溶剂中得到。其中，所述提取液或有机溶剂优选为醋酸溶液。优选地，所述釉基质蛋白粗提液为釉基质蛋白的饱和溶液。
16.本发明步骤s2中，所述三氯乙酸溶液优选地通过滴加的方式加入到所述釉基质蛋白粗提液中，这样能够使得蛋白能够充分地析出沉淀。其中，对于三氯乙酸溶液的浓度不限，优选为10％～20％，例如可以为10％、12％、15％、16％、 18％、20％等。需要指出的是，此处三氯乙酸的浓度为质量体积浓度，以配制浓度为10％的三氯乙酸为例，称取10g三氯乙酸，加水溶解后，定容至100ml，得到的溶液即为10％的三氯乙酸水溶液。
17.本发明步骤s2中，向釉基质蛋白粗提液中加入三氯乙酸溶液后，需要保证溶液中三氯乙酸的浓度c≥1.35％。当c≥1.35％时，析出的蛋白沉淀绝大部分为 p148，而其他几种蛋白的析出量几乎为0。但是，三氯乙酸的浓度也不可过高，若浓度c＞1.40％，则釉基质蛋白粗提液中绝大部分的p148都被沉淀下来，导致分离纯化的p148的产量偏低。优选地，三氯乙酸的浓度c满足：1.35％≤c≤1.40％。例如，c可以为1.35％、1.36％、1.37％、1.38％、1.39％、1.40％等等。
18.进一步地，步骤s2中，所述孵育的时间为1～5min。加入三氯乙酸溶液后，通过孵育，能够使得trap、p173和p161三类蛋白充分地析出沉淀，避免在后续添加三氯乙酸时析
出，从而避免对釉原蛋白p148的纯度产生影响。
19.进一步地，步骤s3中，所述离心的离心力为3000～5000g，离心时间为3～10 min。
20.本发明步骤s4中，向上清液中继续加入三氯乙酸溶液后，体系中的三氯乙酸的浓度进一步提高，因此p148蛋白继续析出，而其他三种蛋白几乎不析出，从而沉淀物中的成分几乎全为p148。但是当三氯乙酸的浓度c超过1.70％后， p148的析出量很少，因此优选地，加入三氯乙酸溶液后，控制溶液中三氯乙酸的浓度c≤1.7％。
21.进一步地，步骤s4中，收集到的沉淀物再使用溶剂重悬，以除去残余的三氯乙酸。接着再通过离心去除溶剂，静置干燥后，得到纯白色的p148蛋白干粉。
22.进一步地，步骤s4中，所述溶剂为乙醇。
23.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
24.1.本发明利用三氯乙酸具备分级沉淀的效果这一特性，通过控制不同浓度的三氯乙酸对釉基质蛋白进行分级沉淀，最终从釉基质蛋白粗提液中分离得到了高纯度的釉原蛋白p148。该提取工艺简单可行，无需采用凝胶渗透色谱、反相液相色谱等色谱辅助手段，大大简化了纯化的流程，降低了纯化的成本。并且该方法重复性好，可进行大批量生产高纯度的p148蛋白，产业化前景较好。
25.2.本发明分离的蛋白组分p148，具有很高的纯度，可以排除其他蛋白组分的影响，适用于牙釉质矿化机理研究和材料仿生研究和牙周再生药品的研发和生产。
附图说明
26.图1为使用三氯乙酸法对醋酸蛋白溶液进行沉淀操作的流程；
27.图2为沉淀1～4的色谱洗脱曲线峰形；
28.图3为沉淀5～8的色谱洗脱曲线峰形；
29.图4是实施例2中提取的产物的电泳图；
30.图5是实施例2中提取的产物的质谱图。
具体实施方式
31.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
32.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
33.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
34.一、仪器与试剂
35.1.仪器
36.安捷伦1100高效液相色谱，高速离心机(型号：tg16.5)，10ml水平转子，尖底离心管。
37.2.试剂
38.未萌发的猪臼齿(实验室提供)；三氯乙酸(99％，阿达玛斯试剂有限公司)；冰醋酸(分析纯，广州化学试剂有限公司)；丙酮(分析纯，广州化学试剂有限公司)；乙腈(adamas-beta hplc级)；纯水(millipore)。
39.二、试验与表征
40.实施例1
41.1.釉基质蛋白样品的制备
42.1.1三氯乙酸沉淀上清液的制备
43.从猪的下颌骨里边挖出未萌发的智齿，洗净血渍，然后用刀片刮取富含有机质的疏松牙釉质，用0.5m醋酸低温搅拌抽提24h。离心去除醋酸蛋白溶液里的固体杂质，得到釉基质蛋白醋酸溶液。
44.1.2三氯乙酸法制得的蛋白沉淀
45.使用三氯乙酸法对醋酸蛋白溶液进行沉淀操作，操作步骤如图1，具体方法为：取8ml釉基质蛋白溶液，置于10ml尖底离心管中，以离心管为蛋白沉淀的容器。首次三氯乙酸沉淀操作时，使用移液枪加入300微升15％三氯乙酸溶液，随着三氯乙酸液流加入，可见液流所到之处有白色蛋白沉淀析出。稍微震荡摇匀离心管，孵育1分钟。盖上离心管盖，水平转子4000g离心5分钟，收集上清转移至另一离心管，然后在上清液中再次加入100微升15％三氯乙酸，离心得到沉淀2；转移上清至另一离心管，再次加入100微升15％三氯乙酸，离心得到沉淀3，以此类推，得到8个沉淀。分别对应不同浓度梯度下三氯乙酸对应析出的釉基质蛋白沉淀。
46.2.釉基质蛋白沉淀的表征
47.2.1蛋白沉淀的hplc色谱分析
48.8个沉淀使用乙醇重悬，清洗残存的三氯乙酸，离心除去乙醇，静置挥发干燥，每管分别加入800μl纯水，使8个沉淀样品都完全溶解。加入样品瓶进行hplc分析。进样量为100μl，设置220nm为监测波长。所有样品使用的色谱制度保持一致，尽量将重要组分的几个峰形分开，以利于三氯乙酸沉淀效果的比对。
49.2.2结果与讨论
50.观察获得的8个蛋白沉淀，均能在纯水中完全复溶，未观察到所谓三氯乙酸会完全破坏蛋白结构的现象。
51.釉基质蛋白中最重要的几种蛋白为trap、p148、p173和p161。它们的含量和相对比例可以用来清晰评价三氯乙酸沉淀的效果。所得8个沉淀的色谱图分列于图2和图3中，色谱图中已对已知的重要组分进行身份标定，从色谱图中可知，因为采取了一致的色谱分析制度，trap、p148、p173和p161在不同 hplc色谱图中的保留时间高度稳定。结合图3和图4的色谱洗脱曲线峰形可知，不同沉淀阶段所得几种典型蛋白组分的相对比例和质量一直在变化，仅此就直接说明三氯乙酸沉淀法也是一种典型的分级沉淀方法。通过控制三氯乙酸的浓度，把不同组成蛋白质沉淀从混合溶液中分步沉淀出来，达到分离目的蛋白质的效果，可为总蛋白的分段切割、定向纯化和组分配伍提供可能。
52.峰面积与该区段沉淀蛋白的量成正比关系，使用安捷伦1200自带的 chemstation软件对各蛋白的峰面积进行积分，峰面积展示如表1所示。
53.表1各沉淀蛋白信号峰的峰面积
[0054] trapp148p173p161沉淀一(0-300μl)29121.6141183915.83189.4沉淀二(300-400μl)39608.2339136009.25545.8沉淀三(400-500μl)22790.744754.93700.94375.4沉淀四(500-600μl)15172.85412522632272.7沉淀五(600-700μl)1873.917944.3333.7175沉淀六(700-800μl)50715277.8132
‑‑‑
沉淀七(800-900μl)
‑‑‑
10973
‑‑‑‑‑‑
沉淀八(900-1000μl)
‑‑‑
5919.8
‑‑‑‑‑‑
[0055]
从三氯乙酸沉淀的结果和趋势分析可得：
[0056]
①
0-300μl过程中，trap、p148、p173和p161的峰面积分别为29121.6、 14118、3915.8和3189.4。300-400μl区段，trap、p148、p173和p161的峰面积分别增长到39608.2、33913、6009.2和5545.8。这说明采用三氯乙酸沉淀，也是需要达到一定浓度后，才能发挥沉淀作用。
[0057]
②
400-500μl阶段，trap、p173和p161峰面积为22790、3700.9和4375.4，较300-400μl阶段呈现下降趋势，并且这种下降趋势一直保持。说明这几种蛋白对较低浓度的三氯乙酸敏感，而p148的峰面积则持续增长，并在500-600μl 三氯乙酸区间达到峰值。不论何种蛋白，其沉淀量都随溶液中三氯乙酸浓度增加，呈现前期上升趋势，后期下降的趋势。这种情况清楚说明：不同种类的蛋白质，其达到最大量沉淀时，对应三氯乙酸的浓度不同。
[0058]
③
800-900μl阶段，trap、p173和p161的峰面积接近为零，而p148的峰面积为10973，说明此时获得的蛋白沉淀为高纯度的p148。这种结果也能在沉淀的视觉感受上获得验证，因为前期的蛋白沉淀呈现淡黄色，至800-900μl 阶段，沉淀为纯白色，这也是纯p148蛋白干粉的颜色特征。这种结果提示我们，只采用三氯乙酸沉淀法这一简单的沉淀方法，就具有从复杂蛋白系统中获得某种高纯度蛋白的可能性。
[0059]
实施例2
[0060]
取8ml实施例1中制备的釉基质蛋白溶液，置于10ml尖底离心管中。使用移液枪加入800微升15％三氯乙酸溶液(加入后，釉基质蛋白溶液中三氯乙酸的浓度为1.36％)，随着三氯乙酸液流加入，可见液流所到之处有白色蛋白沉淀析出。稍微震荡摇匀离心管，孵育3分钟。盖上离心管盖，水平转子4000g 离心5分钟，收集上清转移至另一离心管。然后在上清液中再次加入100微升 15％三氯乙酸(加入后，上清液中三氯乙酸的浓度为1.52％)，离心得到沉淀。使用乙醇将沉淀进行重悬，清洗残存的三氯乙酸，离心除去乙醇，再静置挥发干燥，得到纯白色的p148蛋白干粉。
[0061]
图4和图5分别是实施例2中提取的p148蛋白沉淀的电泳图和质谱图。从电泳图中可以看出，该沉淀物中杂质蛋白的含量很少。从质谱图中也可以看出，该沉淀物中的杂质含量很低(杂峰少)，并且只有一个分子造成的两个信号峰，其中16875.666代表p148带一个电荷，8451.792代表p148带两个电荷(双电峰)。两个峰都是p148分子产生的信号，这证明了最后得到的沉淀物为p148蛋白。
[0062]
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明
的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。