一种高表达和高活性纤连蛋白突变体及其应用

本发明涉及生物医药，具体涉及一种高表达和高活性纤连蛋白突变体及其应用。

背景技术：

1、纤连蛋白是一种细胞外基质(ecm)的粘附分子，其广泛存在于血液、体液及各类组织中的高分子糖蛋白。分子量为450kda，由两个220kda的亚基通过二硫键连接形成。亚基有6个致密球状体构成，每个区域都有特定的功能可以与特殊的配体结合，具有多种生物学功能。fn中至少存在两个独立于细胞附着的区域，其一是在fn中心位置，具有两个协同作用的氨基酸序列arg-gly-asp(rgd)和pro-his-arg-asn(phrsn)，另一个在羧基端附近，iiics交替拼接，关键小序列是leu-asp-val(ldv)和arg-glu-asp-val(redv)。rgd是α5β1、αvβ3、αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、α8β1整合素的常见结合位点。有研究表明，当细胞同时存在αvβ1与α5β1时，才能够促进细胞增殖。fn基因位于2号染色体上75kb左右，拥有50个左右的外显子，基因序列的90％以上都是通过fni型ii型iii型重复排列组成。它的主要结构和排列方式从(n-c)端依次为：①6个fni、②2个fnii、③3个fni、④14个fniii、⑤v区(iiics区)、⑥1个fniii和⑦3个fni。

2、纤连蛋白是细胞外基质的重要组成部分，通过与细胞表面受体及细胞外基质分子的相互作用，促进细胞粘附、迁移，促进创伤修复，因此，纤连蛋白在医学、美容、护肤领域有广泛的应用前景。虽然动物组织、血液中含有纤连蛋白，但是含量极为有限，因此，组织来源的纤连蛋白存在产量低，成本高，产品纯度低的缺点。重组dna技术通过构建线路蛋白基因的表达载体，在原核或者真核生物中表达、制备高纯度的纤连蛋白。纤连蛋白单体约220～250kda，分子量较大，研究表明，通过选择纤连蛋白上的部分结构域，重组dna技术制备含有纤连蛋白部分结构域的突变体，具有纤连蛋白的生物学活性。但是，如何筛选纤连蛋白的活性结构域进行重构，获得高活性、高稳定性的纤连蛋白突变体是制约纤连蛋白应用的关键技术之一。此外，重组蛋白异源表达时，往往表达量低，或者以包涵体形式表达，这也是制约纤连蛋白应用的另一关键技术。

3、且最新的研究表明：不同的dna虽然可以翻译成同样的氨基酸，蛋白质生成的速度(翻译速度)并非恒定，在某些区段上会比较缓慢，这种现象称为翻译暂停(translationalpausing或translational attenuation)翻译暂停位点与蛋白质折叠高度相关，若翻译暂停位点不正确，该慢的地方快了，或者该快的地方慢了，都将导致蛋白质错误折叠聚集，无法得到有功能的可溶性蛋白。

技术实现思路

1、针对现有技术不足，本发明提供一种高表达和高活性纤连蛋白突变体。

2、为实现以上目的，本发明的技术方案通过以下技术方案予以实现：

3、一种高表达和高活性纤连蛋白突变体，所述高表达和高活性纤连蛋白突变体为优化后的纤连蛋白突变体d8910，所述纤连蛋白突变体d8910为选取纤连蛋白与细胞粘附活性密切相关的结构域，构建得到。

4、优选的，所述优化的纤连蛋白突变体d8910的核苷酸序列如seq id no.1。

5、优选的，所述优化的方式为通过翻译暂停理论对纤连蛋白突变体d8910的核苷酸序列进行优化。

6、优选的，所述翻译暂停理论具体的设计方式为设计编码纤连蛋白的核苷酸序列，在不改变纤连蛋白氨基酸序列的情况下，将纤连蛋白密码子中翻译速度较快的密码子替换成翻译速度较慢的密码子，制造翻译暂停位点。

7、优选的，所述高表达和高活性纤连蛋白突变体的制备方法为：将优化后的纤连蛋白突变体d8910与表达载体构建成重组载体，再将重组载体转化到宿主细胞中进行表达、纯化，来获得高表达和高活性的d8910重组纤连蛋白。

8、优选的，所述表达载体为质粒pet-28系列载体，所述宿主细胞为大肠杆菌。

9、优选的，所述高表达和高活性纤连蛋白突变体在促细胞增殖、迁移、粘附活性中的应用。

10、优选的，所述应用为在制备促进细胞迁移、黏附、增殖、止血及组织修复等产品中的应用。

11、本发明提供一种高表达和高活性纤连蛋白突变体及其应用，与现有技术相比优点在于：

12、(1)本发明选取纤连蛋白与细胞粘附活性密切相关的结构域，构建纤连蛋白突变体d8910并对其采用翻译暂停理论设计优化，优化的纤连蛋白突变体在核糖体上的翻译过程中，在c末端翻译速度会显著降低，使得翻译的纤连蛋白能够有足够的时间进行折叠，能够稳定的获得具有功能性的可溶性蛋白。

13、(2)本发明提供的纤连蛋白突变体，具有高活性和高表达能力，能够在有效保证重组纤连蛋白促细胞粘附活性的同时，提升提升重组纤连蛋白的促细胞增殖活性和促细胞迁移活性，给实际的实验室应用和医疗等产品的开发提供一个良好的基础。

技术特征：

1.一种高表达和高活性纤连蛋白突变体，其特征在于，所述高表达和高活性纤连蛋白突变体为优化后的纤连蛋白突变体d8910，所述纤连蛋白突变体d8910为选取纤连蛋白与细胞粘附活性密切相关的结构域，构建得到。

2.根据权利要求1所述的一种高表达和高活性纤连蛋白突变体，其特征在于：所述优化的纤连蛋白突变体d8910的核苷酸序列如seq id no.1。

3.根据权利要求1所述的一种高表达和高活性纤连蛋白突变体，其特征在于：所述优化的方式为通过翻译暂停理论对纤连蛋白突变体d8910的核苷酸序列进行优化。

4.根据权利要求3所述的一种高表达和高活性纤连蛋白突变体，其特征在于：所述翻译暂停理论具体的设计方式为设计编码纤连蛋白的核苷酸序列，在不改变纤连蛋白氨基酸序列的情况下，将纤连蛋白密码子中翻译速度较快的密码子替换成翻译速度较慢的密码子，制造翻译暂停位点。

5.根据权利要求1所述的一种高表达和高活性纤连蛋白突变体，其特征在于：所述高表达和高活性纤连蛋白突变体的制备方法为将优化后的纤连蛋白突变体d8910与表达载体构建成重组载体，再将重组载体转化到宿主细胞中进行表达、纯化，来获得高表达和高活性的d8910重组纤连蛋白。

6.根据权利要求5所述的一种高表达和高活性纤连蛋白突变体，其特征在于：所述表达载体为质粒pet-28系列载体，所述宿主细胞为大肠杆菌。

7.一种如权利要求1-6所述的高表达和高活性纤连蛋白突变体的应用，其特征在于：所述高表达和高活性纤连蛋白突变体在促细胞增殖、迁移、粘附活性中的应用。

8.根据权利要求7所述的一种高表达和高活性纤连蛋白突变体的应用，其特征在于：所述应用为在制备促进细胞迁移、黏附、增殖、止血及组织修复等产品中的应用。

技术总结
本发明提供一种高表达和高活性纤连蛋白突变体及其应用，涉及生物医药技术领域。所述高表达和高活性纤连蛋白突变体的编码序列如SEQ ID NO.1，且该纤连蛋白突变体为选取纤连蛋白与细胞粘附活性密切相关的结构域，构建纤连蛋白突变体D8910，并将纤连蛋白突变体D8910采用翻译暂停理论设计编码纤连蛋白的核苷酸序列，在不改变纤连蛋白氨基酸序列的情况下，将纤连蛋白密码子中翻译速度较快的密码子替换成翻译速度较慢的密码子，制造翻译暂停位点来优化获得。本发明克服了现有技术的不足，由此纤连蛋白突变体建重组载体、表达、纯化得到的重组纤连蛋白，能够有效促进细胞增殖活性和粘附活性。

技术研发人员：熊盛,刘启伟,陈伟,谢心善,谢秋玲,彭燕辉,王一婷
受保护的技术使用者：暨南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12