一种乳酸片球菌、其糖代谢能力的适应性进化方法及应用与流程

本发明属于生物技术和微生物，具体涉及一种乳酸片球菌的菌株，以及维持该乳酸片球菌菌株高效糖代谢能力的适应性进化方法及应用。

背景技术：

1、l-乳酸作为生物可降解型塑料聚乳酸pla的聚合单体，其市场需求量在不断增长。目前，生产l-乳酸的方法主要为微生物发酵法，但绝大多数发酵微生物在糖的利用上存在葡萄糖抑制作用，非葡萄糖单糖(木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖)的利用速率远低于葡萄糖代谢速率，造成这几种非葡萄糖单糖的利用速率低。因此，寻求同时高效利用葡萄糖和非葡萄糖单糖的生物炼制菌株成为当务之急。

2、经过基因改造的乳酸片球菌具有利用木糖的能力，还同时具有利用葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖的能力，可将这五种可发酵单糖都转化为目标产物l-乳酸。但菌株经过多次传代后可能会出现可发酵糖(如葡萄糖)代谢能力退化的现象，导致糖代谢速率降低、l-乳酸生成变缓。因此，为维持乳酸片球菌高效利用这几种可发酵糖的能力，驯化一种乳酸片球菌的菌株并建立维持该乳酸片球菌高效糖代谢能力的适应性方法，对于应用于乳酸及聚乳酸的工业化生产是非常有必要的。

技术实现思路

1、为解决现有技术的乳酸片球菌出现糖代谢能力退化，从而导致可发酵单糖代谢速率降低和l-乳酸生成变缓的问题，本发明提供了一种乳酸片球菌的进化菌株，所述的菌株具有高效利用可发酵单糖和l-乳酸发酵的性能。此外，本发明还提供了一种使乳酸片球菌适应性进化的方法，以简单有效地维持乳酸片球菌对可发酵单糖的高效利用和l-乳酸发酵的性能。

2、为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之一为：一种乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)，其保藏编号为cctcc no：m 20221291。

3、本发明提供的技术方案之二为：一种使乳酸片球菌适应性进化的方法，所述方法包括如下步骤：

4、(1)将乳酸片球菌作为出发菌株；

5、(2)对所述乳酸片球菌在含不同浓度的可发酵单糖的培养基中进行单阶段或多阶段的适应性进化培养，获得目的菌株；其中，

6、所述可发酵单糖选自葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖中的一种或多种。

7、在一些实施方案中，所述可发酵单糖为包含葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖的混合糖；和/或，所述可发酵单糖与培养基形成可发酵单糖混合培养基。

8、在一些实施方案中，所述乳酸片球菌具有利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖的能力，优选为保藏编号为cgmcc no:13611的乳酸片球菌。

9、在一些实施方案中，步骤(2)中，所述培养基为简化mrs培养基。

10、在一些实施方案中，步骤(2)中，所述培养基包括以下组分：蛋白胨8～15g/l、酵母提取物8～15g/l、无水乙酸钠3～8g/l、柠檬酸氢二铵1～5g/l、无水磷酸氢二钾1～5g/l、七水合硫酸镁0.5～2g/l以及一水合硫酸锰0.1～1g/l。

11、在一些实施方案中，步骤(2)中，所述混合糖包括以下组分：葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖以及半乳糖，其浓度随不同的驯化阶段而变化。

12、在一些实施方案中，步骤(2)中，在混合糖条件下进行如下2个阶段以上的适应性进化培养，使所述乳酸片球菌的糖代谢能力和l-乳酸发酵性能达到稳定：

13、第i阶段：将所述出发菌株在所述的可发酵单糖混合培养基中培养，混合糖浓度为：葡萄糖50～100g/l、木糖30～80g/l、阿拉伯糖5～20g/l、甘露糖1～10g/l、半乳糖1～10g/l，在摇床中培养的温度控制为40～48℃，每12～36h转接一次，连续转接10～100次；

14、第ii阶段：继续在可发酵单糖混合培养基中培养，仅将木糖浓度提高至90～140g/l，葡萄糖浓度降低至5～20g/l，其他糖浓度保持不变，连续转接10～100次；

15、进一步地，所述步骤(2)中包括第iii阶段：将葡萄糖和木糖浓度分别恢复至50～100g/l和30～80g/l，其他糖浓度保持不变，连续转接10～30次，至菌株的糖代谢能力和l-乳酸发酵性能达到稳定，即得所述目的菌株。

16、在一些实施方案中，步骤(2)中，所述的适应性培养的ph值为5.0～6.0，例如通过添加氢氧化钠、氢氧化钙、caco3粉末中任意一种或两种以上的组合物来调节ph值。

17、本发明提供的技术方案之三为：一种生产l-乳酸的方法，所述的方法包括：将如技术方案之一所述的乳酸片球菌的菌株或使用如技术方案之二所述的方法获得的目的菌株用于发酵生产l-乳酸。

18、在一些实施方案中，所述发酵生产l-乳酸的条件包括：发酵温度控制为40～48℃，优选为42℃；转速控制为50～350rpm，进一步为150～350rmp，优选为150rmp；ph值为5.0～6.0，优选ph值为5.5；发酵时间为72～96h，即得l-乳酸发酵液；例如使用ca(oh)2溶液调节发酵体系的ph值至上述范围。

19、优选地，将所述的l-乳酸发酵液中提取的l-乳酸进行提纯、缩聚和解聚后制备l-丙交酯。

20、本发明提供的技术方案之四为：如技术方案之一所述的乳酸片球菌或使用如技术方案之二所述的方法获得的目的菌株在生产l-乳酸或生产l-丙交酯中的应用。

21、本发明的积极进步效果在于：

22、进化得到的乳酸片球菌菌株可稳定地保持高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖的能力，在混合糖的合成培养基发酵过程中，进化菌株展现出葡萄糖代谢加快、l-乳酸生成加快以及木糖的利用速率稳定的优良性能。进化菌株的葡萄糖消耗速率和l-乳酸生成速率分别提高了43.8％和20.8％。本发明可以简单有效地维持乳酸片球菌菌株对可发酵单糖的高效利用能力和l-乳酸发酵性能，具有良好的应用前景。

23、生物材料保藏信息

24、本发明的乳酸片球菌菌株zy65，已于2022年08月17日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学；保藏编号为：cctcc no：m 20221291，培养物名称为pediococcus acidilactici zy65，分类命名为乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)。

技术特征：

1.一种乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)，其特征在于，所述乳酸片球菌的保藏编号为cctcc no：m 20221291。

2.一种使乳酸片球菌适应性进化的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

3.如权利要求2所述的适应性进化方法，其特征在于，所述可发酵单糖为包含葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖的混合糖；和/或，所述可发酵单糖与培养基形成可发酵单糖混合培养基，和/或，

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述培养基为简化mrs培养基；和/或，所述培养基包括以下组分：蛋白胨8～15g/l、酵母提取物8～15g/l、无水乙酸钠3～8g/l、柠檬酸氢二铵1～5g/l、无水磷酸氢二钾1～5g/l、七水合硫酸镁0.5～2g/l以及一水合硫酸锰0.1～1g/l。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，在混合糖条件下进行如下2个阶段以上的适应性进化培养，使所述乳酸片球菌的糖代谢能力和l-乳酸发酵性能达到稳定：

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中还包括第iii阶段：将葡萄糖和木糖浓度分别恢复至50～100g/l和30～80g/l，其他糖浓度保持不变；连续转接10～30次，至菌株的糖代谢能力和l-乳酸发酵性能达到稳定，即得所述目的菌株。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的适应性进化培养的ph值为5.0～6.0，例如通过添加氢氧化钠、氢氧化钙、caco3粉末中任意一种或两种以上的组合物来调节ph值。

8.一种生产l-乳酸的方法，其特征在于，所述方法包括：将如权利要求1所述的乳酸片球菌的菌株或使用如权利要求2～7任一项所述的方法获得的目的菌株用于发酵生产l-乳酸。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵生产l-乳酸的条件包括：发酵温度控制为40～48℃；转速控制为50～350rpm，进一步为150～350rpm；ph值为5.0-6.0，发酵时间为72-96h，即得l-乳酸发酵液；

10.如权利要求1所述的乳酸片球菌或权利要求2～7任一项所述的方法获得的目的菌株在生产l-乳酸或生产l-丙交酯中的应用。

技术总结
本发明公开了一种乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)，其保藏编号为CCTCC NO：M 20221291。还公开了一种使乳酸片球菌适应性进化的方法，所述方法包括：将乳酸片球菌在不同浓度的可发酵单糖条件下进行适应性进化。进化得到的新菌株可以稳定地维持高效利用可发酵单糖的能力，且对葡萄糖和木糖的利用速率稳定，并使葡萄糖的消耗速率和L‑乳酸生成速率分别提高了43.8％和20.8％。本发明提供的方法可简单有效地维持乳酸片球菌对可发酵单糖的高效利用和L‑乳酸发酵的性能，具有良好的应用前景。

技术研发人员：何妮玲,李治斌,鲍杰,徐敏,刘修才
受保护的技术使用者：上海凯赛生物技术股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/27