一种鳜crispr/cas9n基因编辑方法
技术领域
1.本发明提出一种鳜crispr/cas9n基因编辑方法，属于水产动物遗传育种和基因验证研究领域。
背景技术：
2.鳜鱼，学名鳜(siniperca chuatsi)，又称翘嘴鳜、季华鱼。常洄游在静水或缓流的水体中，在水草茂盛的江河湖泊中数量居多。鳜鱼是我国优质名贵鱼类，生性凶猛，以小型鱼虾为饵料，具有生长速度快，抗病力较强等特点。其肉质细嫩、味道鲜美、、蛋白质含量高等营养价值，具有补五脏、益脾胃、充气血、疗虚损等功效，是一种经济价值极高的名贵水产品。开展鳜的遗传育种，培育鳜养殖品种，是满足人类对鳜产品日益增长的需求，保护野生鳜资源的关键。但是，鳜的基因功能研究和遗传改良育种一直受制于缺乏有效的技术手段。
3.基因编辑技术是利用靶向性的序列引导核酸酶对基因组进行定点突变或精准修饰的技术。其主要包括锌指核酸酶zfn、tale核酸酶、crispr/cas9系统和crispr/cas9n系统。基因编辑技术在基因功能研究与经济物种的遗传改良中得到了广泛应用，如斑马鱼、青鳉等模式鱼类，以及罗非鱼、虹鳟、鲤、沟鲶、野鲮、半滑舌鳎和黄鳝等经济鱼类。并且，迄今没有在鳜中建立基因编辑技术。
4.现有专利(公告号：cn107974466)公开了一种鲟鱼crispr/cas9基因编辑方法。现有的用于基因编辑的crispr/cas9系统通常采用混合注射的方式，将cas9和grna混合注射到受精卵中，发明人在实现该方案的过程中发现现有技术中存在如下问题没有得到良好的解决：1、现有技术对于受精卵的要求较高，需要1细胞期受精卵，若使用其他时期受精卵会极大的降低成功率；2、该方法通过直接注射cas9蛋白的方式，省略了mrna的翻译过程，但是crispr/cas9 是通过nhej修复，增加了不必要的插入缺失突变的发生。
5.建立鳜基因编辑技术，一方面可以应用于鳜功能基因研究；另一方面可以探索硏制鳜养殖新品系，为养殖鳜提供遗传改良的优良品种，保护鳜野生资源。因此，如何建立一种鳜基因编辑技术，成为本领域技术人员有待解决的技术问题。
技术实现要素：
6.针对上述现有技术的不足，本发明要解决的技术问题是：建立一种鳜基因编辑技术，一方面可以用于鳜功能基因研究；另一方面可以用于探索硏制鳜养殖新品系，为养殖鳜提供遗传改良的优良品种，保护鳜野生资源。
7.为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：
8.一种鳜crispr/cas9n基因編辑的方法，包括将cas9n蛋白与靶基因grna混合后，利用显微操作的方式注射到待受精卵子中，通过人工受精的方式，得到基因突变的受精卵和胚胎。
9.1)挑选性成熟的鳜亲鱼：
10.用0.3
×
danieau buffer将卵子液稀释10倍，随后洗去多余的粘液，即获得可用于
显微注射的待受精卵子。
11.2)构建鳜靶基因(ig1)的grna：
12.针对鳜的靶基因ig1设计grna靶点，将cas9n蛋白与grna混合，并加入少量无rna酶的酚红终浓度为cas9n 0.1mg/μl及grna0.03mg/μl)显微注射鳜待受精卵子。
13.3)显微注射鳜待受精卵子
14.将刚鳜1待受精卵子放置在略有覆盖的0.3
×
danieau buffer玻璃培养皿中。将cas9n蛋白与 grna的混合溶液逐枚注射到鳜待受精卵子中。
15.4)待受精卵子进行人工受精
16.用0.3
×
danieau buffer将精液稀释100倍，进行人工受精。受精时间1.5min，随后洗去多余的精液，即获得鳜受精卵。
17.5)筛选靶基因突变的鳜
18.待鳜受精卵发育至神经胚期或尾芽期，收集胚胎并以常规方法提取基因组dna。用检测引物f2-5’cgtgtaaaaggggcaacacc 3’和r2-5’tgtctgcacccctctctctt 3’扩增靶位点的基因部分片段。
19.优选的，cas9n蛋白与靶基因grna的终浓度分别为0.1mg/μl和0.03mg/μl。
20.优选的，每个待受精卵子注射体积为1.5～2nl。
21.优选的，所述的鳜包括但不限于翘嘴鳜(siniperca chuatsi)、斑鳜(s.scherzeri)、大眼鳜 (s.kneri garman)。
22.有益效果
23.采用本发明提供的技术方案，与现有技术相比，具有如下的有益效果：
24.目前没有任何进行鳜胚胎的显微操作技术，更没有进行鳜外源基因精准编辑的技术。本发明首次发现鳜待受精卵子卵壳比较柔软，具有一定硬度的毛细玻璃针可以顺畅地刺入待受精卵子内，而后通过人工受精，得到基因突变的受精卵，成功实施基因转移的显微操作。本发明第一次建立鳜外源基因精准编辑技术，为开展鳜基因的功能研究和鳜养殖品种的遗传改良提供了强有力的技术手段。
25.现有的用于基因编辑的crispr/cas9系统通常采用混合注射的方式，将cas9和grna混合注射到受精卵中，但是对受精卵的要求较高，需要1细胞期受精卵，当精子进入卵子后，卵子会变为受精卵，并增加卵壁厚度，保护受精卵和防止其他精子进入，所以本技术提供的一种鳜crispr/cas9n基因编辑方法，通过将cas9n蛋白和grna混合注射进入待受精卵子中，通过对卵壁较薄的卵子进行显微注射，增加了成功率，此外，cas9n与dna双链作用时仅产生单链切口，并且由cas9n催化的单链断裂是通过hdr进行修复的，大大降低了不必要的插入缺失突变的发生。
具体实施方式
26.下面结合给出实施例并对本发明进行具体描述。此次公开的实施方式可以认为在所有方面均为例示，不具限制性。本发明的范围不受以下实施方式的说明所限，仅由权利要求书的范围所示，而且包括与权利要求范围具有同样意思及权利要求范围内的所有变形。
27.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具
体的实施目的，不是旨在于限制本发明；本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
28.本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或材料，如未特別说明，均来源于商业渠道。本发明以在鳜中编辑ig1基因为例，对本发明的方法进行说明；利用本发明提供的方法，也能对其他鳜进行外源基因的编辑，该技术可以用于研究鳜基因的功能和鳜品种的遗传改良。
29.实施例1：
30.一种鳜crispr/cas9n基因编辑方法，包括以下步骤
31.1)挑选性成熟的鳜亲鱼，在室内养殖系统中暂养。距人工繁殖25h前，注射lhrha和dom 混合物进行人工催产，注射剂量为10μg lhrha+1mg dom/kg体重，每隔12h注射1次，雌性鳜连续注射2次，雄性鳜注射l次。待亲鱼有排精/排卵迹象，挤岀卵子液到于燥的烧杯，挤出卵到玻璃平皿。用0.3
×
danieau buffer【17mm nac1,2mm kc1,0.12mm mgso4，1.8mmca(no3)2,1.5mm hepes,ph 7.6】将卵子液稀释100倍，随后洗去多余的粘液，即获得可用于显微注射的鳜待受精卵子。
32.2)构建鳜靶基因(ig1)的guide rna：
33.针对鳜的靶基因ig1(genebank number：cm034670.1)利用设计网站 (http://zifit.partners.org/zifit/)设计grna靶点，为5’gcaacaccagcaacctcatg 3’。按照文献hwang wy,fu y,reyon d,maeder ml,tsai sq,sander jd,peterson rt,yeh jr,joungjk(2013)efficient genome editing in zebrafish using a crispr-cas system.natbiotechnol31:227-229】所述方法合成guide rna(grna)。具体步骤如下：合成两条0ligo序列，f1-5’cctctgcatcttcggtgtgt 3’，r1-5’gcaacaccagcaacctcatg 3’。f1 和r1引物各以10mm混合，先置于95℃5min，然后缓慢降温至37℃。dr274质粒(addgeneplasmid 42250)用bsaⅰ(neb,r0535)酶切后，与退火产物连接。将连接产物转化入感受态大肠杆菌。用引物m13(-47)和引物f1做pcr以挑出阳性克隆。pcr反应条件为：95℃2min， 95℃15s，56℃15s，72℃30s(30个循环)，72℃5min。常规方法提取质粒。用dra i(neb， r0l29)酶切后，胶回收约200bp的片段，用megashortscript kit(ambion，am1354)体外转录成grna，并纯化cas9n蛋白购自life technologies(b25640)。将cas9n蛋白与grna混合，并加入少量无rna酶的酚红终浓度为cas9n 0.1mg/μl及grna0.03mg/μl)显微注射鳜待受精卵子。
34.3)显微注射显微注射鳜待受精卵子
35.将鳜待受精卵子放置在略有覆盖的0.3
×
danieau buffer玻璃培养皿中。在体式显微镜下调整鳜待受精卵子，将cas9n蛋白与grna的混合溶液逐枚注射到鳜待受精卵子中，每枚鳜待受精卵子注射体积为1.5～2nl将显微注射后的鳜待受精卵子置于16℃培养，存活率为93.9％。
36.4)待受精卵子进行人工受精
37.用0.3
×
danieau buffer将精液稀释100倍，进行人工受精。受精时间1.5min，随后洗去多余的精液，即获得鳜受精卵。
38.5)筛选靶基因突变的鳜
39.待鳜受精卵发育至神经胚期或尾芽期，收集胚胎并以常规方法提取基因组dna。用检测引物f2-5’cgtgtaaaaggggcaacacc 3’和r2-5’tgtctgcacccctctctctt 3’扩增靶位点
的基因部分片段。pcr反应条件为：95℃1min，95℃15s，52℃15s，72℃30s(30个循环)，72℃5min。最后将pcr产物置于95℃1min，然后缓慢降温至37℃。将最终的pcr产物以8％聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)，以80v电压电泳1.5h，凝胶用eb染色。根据电泳条带数及亮度，计算靶位点发生突变的频率。根据检测结果，在5组枚显微注射的待受精卵子发育而来的胚胎中，均检测到靶位点的突变，最高突变率达85％。
40.实施例2：
41.选择不同鳜鱼的ig1基因作为靶基因，按照本领域的常规方式构建靶点grna，按照实施例1中的方法，在翘嘴鳜、斑鳜、大眼鳜中均成功进行了鳜的显微操作。
42.以上所述实施例仅表达了本发明的某种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制；应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围；因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。