一种磷脂酰丝氨酸的纯化方法与流程

1.本发明涉及磷脂酰丝氨酸生产工艺，具体涉及一种磷脂酰丝氨酸的纯化方法。


背景技术：

2.磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，英文简称ps)又名丝氨酸磷脂、二酰甘油酰磷酸丝氨酸、复合神经酸等，是一类普遍存在于细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞中的一种重要的膜磷脂。磷脂酰丝氨酸能够改善神经细胞功能，调节神经脉冲的传导，增进大脑记忆功能，因此是一种重要的新资源食品，而作为上述资源使用时，磷脂酰丝氨酸要求的纯度超过50％。
3.磷脂酰丝氨酸的制备可以分为化学法和生物酶法，生物酶法制备需投入过量丝氨酸，反应粗品常常存在大量的丝氨酸以及大量的磷脂类化合物。传统的分离方法包括有机溶剂萃取浓缩，柱层析，膜分离法；有机溶剂萃取法可能存在一定的试剂残留，而磷脂酰丝氨酸的应用范围将集中在普通食品以及保健食品，格外重视溶剂残留。因此国内部分学者将溶液体系以及纯化的研究转移到绿色低毒类溶剂的研究，比如2-甲基四氢呋喃，乳酸乙酯，脂肪酸甲酯等，其他方法如柱层析，膜分离法分离效果虽好，但由于磷脂类化合物大多具有较强的黏性，纯化后的设备清洗工作较为繁琐，并且无法解决料液因粘度过高而导致收率过低的问题。
4.浙江大学的师维等人在《基于离子液体及聚离子液体的磷脂酰丝氨酸分离方法研究》中一文提到多种混合离子液体用于磷脂酰丝氨酸的纯化，可以提高目标产物溶液分配系数，但目前混合离子型溶剂萃取沉淀法所使用的溶剂还缺乏必要的行政许可。
5.申请号为cn201911346201.6文件，公开了一种磷脂酰丝氨酸的纯化方法，其中提到一种只用水进行后处理的除杂方法，除杂需要配合专业的均质和乳化设备，且对温度有严格要求，并不适用于工业化生产。


技术实现要素：

6.本发明意在提供一种磷脂酰丝氨酸的纯化方法，以解决现有技术中磷脂酰丝氨酸需要专业化分离纯化设备和料液黏度过高导致收率过低的问题。
7.为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种磷脂酰丝氨酸的纯化方法，包括：
8.步骤1：通过磷脂酶的酶解反应获得磷脂酰丝氨酸粗品；
9.步骤2：对磷脂酰丝氨酸粗品多次醇洗，其中采用调节浓度和ph值后的乙醇进行醇洗；
10.步骤3：对醇洗后的磷脂酰丝氨酸粗品进行干燥，直至到达磷脂酰丝氨酸产品的质量参数。
11.优选的，所述步骤1中具体包括：进行磷脂酶的酶解反应后，进行固液分离，并收集固体物得到磷脂酰丝氨酸粗品。
12.优选的，作为一种改进，所述步骤2中磷脂酰丝氨酸粗品和乙醇的料液比为1:200g/l。
13.优选的，作为一种改进，所述醇洗的乙醇浓度为70％-90％(v/v)。
14.优选的，作为一种改进，所述醇洗的乙醇ph为5.0-8.0。
15.基于上述磷脂酰丝氨酸的纯化方法，本方案还提供了一种简单易行的酶催化生产磷脂酰丝氨酸的方法，具体包括以下步骤：
16.步骤(1)：将大豆卵磷脂、水、醋酸盐-醋酸钠缓冲液、l-丝氨酸、氯化钙、磷脂酶d混合，在40℃下搅拌反应24h；其中，所述大豆卵磷脂的添加量为200-250g/l水的体积，所述l-丝氨酸的加入量为250-320g/l水的体积，所述氯化钙的加入量为10-20g/l水的体积，所述磷脂酶d的加入量为25-40u/g天然磷脂；
17.步骤(2)：待步骤(1)的反应结束后，进行固液分离，收集固体物，得反磷脂酰丝氨酸粗品；
18.(3)向步骤(2)得到的反应粗品中加入乙醇溶液，混合均匀后进行固液分离，收集固体物，真空干燥后即得磷脂酰丝氨酸产品，其中乙醇溶液的ph在5.0-8.0之间，浓度控制在70％-90％(v/v)之间。
19.优选的，作为一种改进，所述磷脂酶d通过生物发酵制得。
20.优选的，作为一种改进，所述步骤(1)的反应过程中全程氮气保护。
21.本发明提供一种磷脂酰丝氨酸的纯化方法，利用不同浓度和不同ph值的乙醇纯化磷脂酰丝氨酸，获得纯度大于50％的磷脂酰丝氨酸，制备方法简单，实验条件温和，生产成本低，有利用规模化生产和推广。本发明所选用的溶剂均为常见反应溶剂，已经广泛用于磷脂类化合物的纯化工作；无需专业化分离纯化设备，操作简便，并且所获得的磷脂酰丝氨酸粉末粗品，经过恒温真空干燥后，产品纯度可以满足国家发布的新食品原料的要求，为后续推广打下重要基础。
附图说明
22.图1为本发明实施例4中用hplc测定得到的磷脂酰丝氨酸的谱图。
具体实施方式
23.下面通过具体实施方式进一步详细说明：
24.以下实施例将对本发明作出进一步的说明。
25.实施例1：
26.选用大豆卵磷脂，l-丝氨酸，氯化钙，醋酸盐，磷脂酶等进行转酯反应，其中，大豆卵磷脂的添加量为200-250g/l水的体积，本实施例优选为200g/l水的体积，l-丝氨酸的加入量为250-320g/l水的体积，本实施例优选为250g/l水的体积，氯化钙的加入量为10-20g/l水的体积，本实施例优选为10g/l水的体积，磷脂酶d的加入量为25-40u/g天然磷脂，本实施例优选为25u/g天然磷脂，所获得的反应粗品，按照反应粗品与乙醇的质量体积比料为1:200g/l，置于体积分数范围为70％到95％，ph的参数范围在5-8的乙醇溶液，进行恒温水浴震荡，离心并收集沉淀，60℃过夜真空干燥后得到淡黄色粉末状磷脂酰丝氨酸；其中本实施例中乙醇洗涤步骤的参数如下：乙醇溶液的浓度为70％(v/v)，ph为5.0，用于调节溶液ph的
冰醋酸(0.1mol/l)，氨水(质量体积分数为20％),所获得的磷脂酰丝氨酸粉末送hplc，检测其中磷脂酰胆碱pc，磷脂酰丝氨酸ps含量(％)。
27.实施例2：
28.选用大豆卵磷脂，l-丝氨酸，氯化钙，醋酸盐，磷脂酶等进行转酯反应，其中，大豆卵磷脂的添加量为200-250g/l水的体积，本实施例优选为200g/l水的体积，l-丝氨酸的加入量为250-320g/l水的体积，本实施例优选为300g/l水的体积，氯化钙的加入量为10-20g/l水的体积，本实施例优选为10g/l水的体积，磷脂酶d的加入量为25-40u/g天然磷脂，本实施例优选为25u/g天然磷脂，所获得的反应粗品，按照反应粗品与乙醇的质量体积比料为1:200g/l，置于体积分数范围为70％到95％，ph的参数范围在5-8的乙醇溶液，进行恒温水浴震荡，离心并收集沉淀，60℃过夜真空干燥后得到淡黄色粉末状磷脂酰丝氨酸，其中本实施例中乙醇洗涤步骤的参数如下：乙醇溶液的浓度为70％(v/v)，ph为6.0，用于调节溶液ph的冰醋酸(0.1mol/l)，氨水(质量体积分数为20％)，所获得的磷脂酰丝氨酸粉末送hplc，检测其中磷脂酰胆碱pc，磷脂酰丝氨酸ps含量(％)。
29.实施例3：
30.选用大豆卵磷脂，l-丝氨酸，氯化钙，醋酸盐，磷脂酶等进行转酯反应，其中，大豆卵磷脂的添加量为200-250g/l水的体积，本实施例优选为200g/l水的体积，l-丝氨酸的加入量为250-320g/l水的体积，本实施例优选为300g/l水的体积，氯化钙的加入量为10-20g/l水的体积，本实施例优选为20g/l水的体积，磷脂酶d的加入量为25-40u/g天然磷脂，本实施例优选为25u/g天然磷脂，所获得的反应粗品，按照反应粗品与乙醇的质量体积比料为1:200g/l，置于体积分数范围为70％到95％，ph的参数范围在5-8的乙醇溶液，进行恒温水浴震荡，离心并收集沉淀，60℃过夜真空干燥后得到淡黄色粉末状磷脂酰丝氨酸，其中本实施例中乙醇洗涤步骤的参数如下：乙醇溶液的浓度为70％(v/v)，ph为7.0，用于调节溶液ph的冰醋酸(0.1mol/l)，氨水(质量体积分数为20％)，所获得的磷脂酰丝氨酸粉末送hplc，检测其中磷脂酰胆碱pc，磷脂酰丝氨酸ps含量(％)。
31.实施例4：
32.选用大豆卵磷脂，l-丝氨酸，氯化钙，醋酸盐，磷脂酶等进行转酯反应，其中，大豆卵磷脂的添加量为200-250g/l水的体积，本实施例优选为200g/l水的体积，l-丝氨酸的加入量为250-320g/l水的体积，本实施例优选为300g/l水的体积，氯化钙的加入量为10-20g/l水的体积，本实施例优选为20g/l水的体积，磷脂酶d的加入量为25-40u/g天然磷脂，本实施例优选为30u/g天然磷脂，获得的反应粗品，按照反应粗品与乙醇的质量体积比料为1:200g/l，置于体积分数范围为70％到95％，ph的参数范围在5-8的乙醇溶液，进行恒温水浴震荡，离心并收集沉淀，60℃过夜真空干燥后得到淡黄色粉末状磷脂酰丝氨酸，其中本实施例中乙醇洗涤步骤的参数如下：乙醇溶液的浓度为70％(v/v)，ph为8.0，用于调节溶液ph的冰醋酸(0.1mol/l)，氨水(质量体积分数为20％)，所获得的磷脂酰丝氨酸粉末送hplc，检测其中磷脂酰胆碱pc，磷脂酰丝氨酸ps含量(％)。
33.实施例5：
34.选用大豆卵磷脂，l-丝氨酸，氯化钙，醋酸盐，磷脂酶等进行转酯反应，其中，大豆卵磷脂的添加量为200-250g/l水的体积，本实施例优选为200g/l水的体积，l-丝氨酸的加入量为250-320g/l水的体积，本实施例优选为300g/l水的体积，氯化钙的加入量为10-20g/
l水的体积，本实施例优选为20g/l水的体积，磷脂酶d的加入量为25-40u/g天然磷脂，本实施例优选为35u/g天然磷脂，所获得的反应粗品，按照反应粗品与乙醇的质量体积比料为1:200g/l，置于体积分数范围为70％到95％，ph的参数范围在5-8的乙醇溶液，进行恒温水浴震荡，离心并收集沉淀，60℃过夜真空干燥后得到淡黄色粉末状磷脂酰丝氨酸，其中本实施例中乙醇洗涤步骤的参数如下：乙醇溶液的浓度为80％(v/v)，ph为5.0，用于调节溶液ph的冰醋酸(0.1mol/l)，氨水(质量体积分数为20％)，所获得的磷脂酰丝氨酸粉末送hplc，检测其中磷脂酰胆碱pc，磷脂酰丝氨酸ps含量(％)。
35.实施例6：
36.选用大豆卵磷脂，l-丝氨酸，氯化钙，醋酸盐，磷脂酶等进行转酯反应，其中，大豆卵磷脂的添加量为200-250g/l水的体积，本实施例优选为200g/l水的体积，l-丝氨酸的加入量为250-320g/l水的体积，本实施例优选为300g/l水的体积，氯化钙的加入量为10-20g/l水的体积，本实施例优选为20g/l水的体积，磷脂酶d的加入量为25-40u/g天然磷脂，本实施例优选为40u/g天然磷脂，所获得的反应粗品，按照反应粗品与乙醇的质量体积比料为1:200g/l，置于体积分数范围为70％到95％，ph的参数范围在5-8的乙醇溶液，进行恒温水浴震荡，离心并收集沉淀，60℃过夜真空干燥后得到淡黄色粉末状磷脂酰丝氨酸，其中本实施例中乙醇洗涤步骤的参数如下：乙醇溶液的浓度为80％(v/v)，ph为6.0，用于调节溶液ph的冰醋酸(0.1mol/l)，氨水(质量体积分数为20％)，所获得的磷脂酰丝氨酸粉末送hplc，检测其中磷脂酰胆碱pc，磷脂酰丝氨酸ps含量(％)。
37.实施例7：
38.选用大豆卵磷脂，l-丝氨酸，氯化钙，醋酸盐，磷脂酶等进行转酯反应后，其中，大豆卵磷脂的添加量为200-250g/l水的体积，本实施例优选为250g/l水的体积，l-丝氨酸的加入量为250-320g/l水的体积，本实施例优选为300g/l水的体积，氯化钙的加入量为10-20g/l水的体积，本实施例优选为20g/l水的体积，磷脂酶d的加入量为25-40u/g天然磷脂，本实施例优选为40u/g天然磷脂，所获得的反应粗品，按照反应粗品与乙醇的质量体积比料为1:200g/l，置于体积分数范围为70％到95％，ph的参数范围在5-8的乙醇溶液，进行恒温水浴震荡，离心并收集沉淀，60℃过夜真空干燥后得到淡黄色粉末状磷脂酰丝氨酸，其中本实施例中乙醇洗涤步骤的参数如下：乙醇溶液的浓度为80％(v/v)，ph为7.0，用于调节溶液ph的冰醋酸(0.1mol/l)，氨水(质量体积分数为20％)，所获得的磷脂酰丝氨酸粉末送hplc，检测其中磷脂酰胆碱pc，磷脂酰丝氨酸ps含量(％)。
39.实施例8：
40.选用大豆卵磷脂，l-丝氨酸，氯化钙，醋酸盐，磷脂酶等进行转酯反应后，其中，大豆卵磷脂的添加量为200-250g/l水的体积，本实施例优选为250g/l水的体积，l-丝氨酸的加入量为250-320g/l水的体积，本实施例优选为310g/l水的体积，氯化钙的加入量为10-20g/l水的体积，本实施例优选为20g/l水的体积，磷脂酶d的加入量为25-40u/g天然磷脂，本实施例优选为40u/g天然磷脂，所获得的反应粗品，按照反应粗品与乙醇的质量体积比料为1:200g/l，置于体积分数范围为70％到95％，ph的参数范围在5-8的乙醇溶液，进行恒温水浴震荡，离心并收集沉淀，60℃过夜真空干燥后得到淡黄色粉末状磷脂酰丝氨酸，其中本实施例中乙醇洗涤步骤的参数如下：乙醇溶液的浓度为80％(v/v)，ph为8.0，用于调节溶液ph的冰醋酸(0.1mol/l)，氨水(质量体积分数为20％)，所获得的磷脂酰丝氨酸粉末送hplc，
检测其中磷脂酰胆碱pc，磷脂酰丝氨酸ps含量(％)。
41.实施例9：
42.选用大豆卵磷脂，l-丝氨酸，氯化钙，醋酸盐，磷脂酶等进行转酯反应后，其中，大豆卵磷脂的添加量为200-250g/l水的体积，本实施例优选为250g/l水的体积，l-丝氨酸的加入量为250-320g/l水的体积，本实施例优选为320g/l水的体积，氯化钙的加入量为10-20g/l水的体积，本实施例优选为20g/l水的体积，磷脂酶d的加入量为25-40u/g天然磷脂，本实施例优选为40u/g天然磷脂，所获得的反应粗品，按照反应粗品与乙醇的质量体积比料为1:200g/l，置于体积分数范围为70％到95％，ph的参数范围在5-8的乙醇溶液，进行恒温水浴震荡，离心并收集沉淀，60℃过夜真空干燥后得到淡黄色粉末状磷脂酰丝氨酸，其中本实施例中乙醇洗涤步骤的参数如下：乙醇溶液的浓度为90％(v/v)，ph为5.0，用于调节溶液ph的冰醋酸(0.1mol/l)，氨水(质量体积分数为20％)，所获得的磷脂酰丝氨酸粉末送hplc，检测其中磷脂酰胆碱pc，磷脂酰丝氨酸ps含量(％)。
43.实施例10：
44.选用大豆卵磷脂，l-丝氨酸，氯化钙，醋酸盐，磷脂酶等进行转酯反应，其中，大豆卵磷脂的添加量为200-250g/l水的体积，本实施例优选为250g/l水的体积，l-丝氨酸的加入量为250-320g/l水的体积，本实施例优选为320g/l水的体积，氯化钙的加入量为10-20g/l水的体积，本实施例优选为20g/l水的体积，磷脂酶d的加入量为25-40u/g天然磷脂，本实施例优选为38u/g天然磷脂，所获得的反应粗品，按照反应粗品与乙醇的质量体积比料为1:200g/l，置于体积分数范围为70％到95％，ph的参数范围在5-8的乙醇溶液，进行恒温水浴震荡，离心并收集沉淀，60℃过夜真空干燥后得到淡黄色粉末状磷脂酰丝氨酸，其中本实施例中乙醇洗涤步骤的参数如下：乙醇溶液的浓度为90％(v/v)，ph为6.0，用于调节溶液ph的冰醋酸(0.1mol/l)，氨水(质量体积分数为20％)，所获得的磷脂酰丝氨酸粉末送hplc，检测其中磷脂酰胆碱pc，磷脂酰丝氨酸ps含量(％)。
45.实施例11：
46.选用大豆卵磷脂，l-丝氨酸，氯化钙，醋酸盐，磷脂酶等进行转酯反应，其中，大豆卵磷脂的添加量为200-250g/l水的体积，本实施例优选为250g/l水的体积，l-丝氨酸的加入量为250-320g/l水的体积，本实施例优选为320g/l水的体积，氯化钙的加入量为10-20g/l水的体积，本实施例优选为20g/l水的体积，磷脂酶d的加入量为25-40u/g天然磷脂，本实施例优选为40u/g天然磷脂，所获得的反应粗品，按照反应粗品与乙醇的质量体积比料为1:200g/l，置于体积分数范围为70％到95％，ph的参数范围在5-8的乙醇溶液，进行恒温水浴震荡，离心并收集沉淀，60℃过夜真空干燥后得到淡黄色粉末状磷脂酰丝氨酸，其中本实施例中乙醇洗涤步骤的参数如下：乙醇溶液的浓度为90％(v/v)，ph为7.0，用于调节溶液ph的冰醋酸(0.1mol/l)，氨水(质量体积分数为20％)，所获得的磷脂酰丝氨酸粉末送hplc，检测其中磷脂酰胆碱pc，磷脂酰丝氨酸ps含量(％)。
47.实施例12：
48.选用大豆卵磷脂，l-丝氨酸，氯化钙，醋酸盐，磷脂酶等进行转酯反应，其中，大豆卵磷脂的添加量为200-250g/l水的体积，本实施例优选为250g/l水的体积，l-丝氨酸的加入量为250-320g/l水的体积，本实施例优选为320g/l水的体积，氯化钙的加入量为10-20g/l水的体积，本实施例优选为20g/l水的体积，磷脂酶d的加入量为25-40u/g天然磷脂，本实
施例优选为34u/g天然磷脂，所获得的反应粗品，按照反应粗品与乙醇的质量体积比料为1:200g/l，置于体积分数范围为70％到95％，ph的参数范围在5-8的乙醇溶液，进行恒温水浴震荡，离心并收集沉淀，60℃过夜真空干燥后得到淡黄色粉末状磷脂酰丝氨酸，其中本实施例中乙醇洗涤步骤的参数如下：乙醇溶液的浓度为90％(v/v)，ph为8.0，用于调节溶液ph的冰醋酸(0.1mol/l)，氨水(质量体积分数为20％)，所获得的磷脂酰丝氨酸粉末送hplc，检测其中磷脂酰胆碱pc，磷脂酰丝氨酸ps含量(％)。
49.实施例1-12中乙醇浓度和乙醇ph值对磷脂酰丝氨酸ps和磷脂酰胆碱pc含量变化情况如表1所示，
50.表1.不同实施范例下的ps，pc含量变化情况
51.实施例乙醇浓度乙醇phpspc产物状态170％523.59％2.36％淡黄色粉末270％623.18％2.68％淡黄色粉末370％749.87％4.45％淡黄色粉末470％855.66％1.92％淡黄色粉末580％540.01％2.10％淡黄色粉末680％641.47％2.42％淡黄色粉末780％718.35％0淡黄色粉末880％817.81％0淡黄色粉末990％517.14％1.34％淡黄色粉末1090％615.56％1.48％淡黄色粉末1190％733.03％0淡黄色粉末1290％833.66％0淡黄色粉末
52.由表1可得，当乙醇浓度为70％(v/v)时，随着乙醇ph值得逐渐递增，所获得的的磷脂酰丝氨酸ps的含量逐渐增加，磷脂酰胆碱pc先增加后减少；当乙醇浓度为80％(v/v)时，随着乙醇ph值逐渐递增，所获得的磷脂酰丝氨酸ps的含量先增加后减少，磷脂酰胆碱pc先增加后减少；当乙醇浓度为为90％(v/v)时，随着乙醇ph值逐渐递增，所获得的的磷脂酰丝氨酸ps的含量逐渐递增，磷脂酰胆碱pc先增加后减少；且在乙醇浓度为70％(v/v)，乙醇ph值为8时，获得的磷脂酰丝氨酸ps的含量最高，pc残余量相对可接受。
53.附图1为实施例4中用hplc测定得到的磷脂酰丝氨酸的谱图，根据与试验前期所购置的标准品hplc色谱情况对照；结果显示反应终体系中主要由三种成分的产物，分别为磷脂酰丝氨酸(ps,出峰时间为20min)，l-丝氨酸(出峰时间为18min)以及磷脂酰胆碱(pc，出峰时间为27min)；分析谱图，经过两步醇洗后，反应原料磷脂酰胆碱中的大部分杂质，如磷脂酰乙醇胺，磷脂酰肌醇等，已达到除杂目的，体系中存在少量残留的磷脂酰胆碱，主要原因是在特定条件下，磷脂酰胆碱在乙醇中的未完全溶解；图谱中还有呈现主要产物磷脂酰丝氨酸和反应物l-丝氨酸，由于目前酶法制备磷脂酰丝氨酸的转酯反应和水解反应处于一种动态平衡状态。
54.由实施例1-实施例12可得，本发明提供的磷脂酰丝氨酸的纯化方法，利用不同浓度和不同ph值的乙醇纯化磷脂酰丝氨酸，获得纯度大于50％的磷脂酰丝氨酸，制备方法简单，实验条件温和，生产成本低，有利用规模化生产和推广，本发明所选用的溶剂均为常见
反应溶剂，已经广泛用于磷脂类化合物的纯化工作。本技术技术方案无需专业化分离纯化设备，操作简便，并且所获得的磷脂酰丝氨酸粉末粗品，经过恒温真空干燥后，产品纯度可以满足新食品原料的要求，为后续推广打下重要基础。
55.以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。本技术要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。