一种酶法合成胞苷的方法与流程

1.本发明属于生物制药和生物化工技术领域，尤其涉及一种酶法合成胞苷的方法。


背景技术：

2.胞苷(cytidine)即胞嘧啶核苷，是由胞嘧啶的n-1和d-核糖的c-1位置通过β糖苷键连接而成的化合物。是核糖核苷和脱氧核糖核苷合成的前体物质，在生物体内代谢调控中起到重要作用。胞苷作为重要的医药中间体，可用于抗病毒、抗肿瘤以及抗新冠药物的合成。例如扎西他滨(zalcitabine)、卡培他滨(capecitabine)、阿糖胞苷(cytarabine)、环胞苷(ancitabine)、胞磷胆碱钠(cdp-choline)、莫匹拉韦(molnupiravir)等。胞苷的结构如下式：
[0003][0004]
目前国内外胞苷的生产主要分为化学合成法和微生物发酵法。化学合成法主要是在苯甲酰氯保护下，在高压、超声波辐射条件下，以四乙酰核糖和胞嘧啶为底物，利用lewis 酸催化剂，比如四氯化锡(sncl4)、四氯化钛(ticl4)等催化获得(姚其正，核苷化学合成，化学工业出版社，2005)。四氯化锡、四氯化钛不仅成本较高，且在生产过程中容易造成金属离子残留高、环境污染等问题。
[0005]
也有研究者利用n4-酰基胞嘧啶和四乙酰核糖在三甲基硅乙酸酯和b(c6f5)3催化下缩合得到酰基保护胞苷，再经酸性或碱性条件下脱保护得到胞苷，如中国发明专利 cn201810470464.7公开了一种合成胞嘧啶核苷的方法。其工艺方法如下式：
[0006][0007]
此方法仍存在成本高、环保污染问题。
[0008]
也有研究者采用酰基保护的糖类和酰基保护的胞嘧啶为底物，用酸性或偏酸性的离子液体作为催化剂，制备相应酰基保护的胞苷衍生物，然后皂化脱去保护基获得胞苷，如中国发明专利201210088690.1公开了一种制备胞苷的新方法。其工艺方法如下式：
[0009][0010]
此工艺虽克服了vorbrueggen糖苷化法制备胞苷过程中n-硅甲化后稳定性差、易脱保护进而影响后续反应的问题，但此方法仍存在成本高、环境污染问题。
[0011]
胞苷发酵法生产在菌株的筛选、菌株的诱变、菌株的代谢工程改造研究以及发酵工艺的优化上经历几十年的不断探索研究。国外研究较早，以美国和日本的相关研究较为先进，特别是后者成功培育出具有胞苷脱氨酶缺失、3-脱杂氮尿嘧啶抗性、5-氟胞苷抗性、氨甲酰磷酸合成酶活力增强以及高丝氨酸脱氢酶活力缺失等特性的芽孢杆菌突变株，使其最大胞苷产率稳定在30g/l左右。枯草芽孢杆菌合成胞苷的代谢途径如下：
[0012][0013]
国内相关研究起步较晚，以天津大学、天津科技大学、华东理工大学以及苏州华赛生物工程技术有限公司等科研院校或公司为代表，通过菌株的培育、诱变、基因敲除、遗传标记等技术手段获得一定的研究进展。li等对枯草杆菌菌种进行了化学诱变和筛选，获得了突变菌株产胞苷为6.2g/l(li，中国药科大学学报，2009)。fang等在大肠杆菌k12 中对胞苷脱氨酶和高丝氨酸脱氢酶的编码基因进行敲除，同时过量表达来源于解淀粉芽孢杆菌的pyrb-pyra操纵子，胞苷产量达到0.72g/l(fang，biotechnol，2013)。也有研究者通过对大肠杆菌胞苷合成途径进行代谢工程改造，在5l罐中实现了20g/l的胞苷产量，如中国发明专利2017100038337公开了一种生产胞苷的重组微生物及生产胞苷的方法。其e.coli胞苷代谢途径如下：
[0014][0015]
发酵法在成本和环保上比化学法优势巨大，但发酵需要的设备投资规模较大，且发酵过程中容易染杂菌甚至噬菌体，特别是大肠杆菌作为出发菌株进行发酵易染噬菌体溶罐，增加生产成本。
[0016]
因此，需要开发一种替代化学合成、环保安全的胞苷合成方法，且对生产企业来说操作方便、投资少的胞苷合成工艺。


技术实现要素：

[0017]
本发明的目的在于提供一种酶法合成胞苷的方法，旨在解决所述背景技术中化学法合成胞苷成本高、污染大等问题，以及发酵法合成胞苷需要投资大、生产过程中易染菌等问题。为实现所述目的，本发明采用的技术方案是：
[0018]
一种酶法合成胞苷的方法，包括以下步骤：
[0019]
a、将胞嘧啶、嘌呤核苷、磷酸盐加入水中搅拌分散均匀，调ph值后加入hme002酶液，于预定的温度、常压下进行温和反应；
[0020]
b、当反应液中的胞嘧啶转化率达到预定数值时，加热终止反应，反应液降温冷却后过滤分离，滤液旋蒸浓缩得到浓缩液；
[0021]
c、在上述浓缩液中加入95％浓度的乙醇使胞苷结晶析出，过滤分离后固体即为胞苷粗品；
[0022]
d、将上述步骤得到的胞苷粗品进一步精制、干燥，即获得胞苷精品。
[0023]
具体的，a步骤中预定的温度为35～40℃，ph值为7.0～8.0。
[0024]
具体的，a步骤中嘌呤核苷包括肌苷(inosine)、腺苷(adenosine)、鸟苷(guanosine)、黄嘌呤核苷(xanthosine)。
[0025]
具体的，a步骤中磷酸盐包括磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸三钠。
[0026]
具体的，b步骤中胞嘧啶转化率的预定值为》99％，加热终止反应的温度为70～90℃，降温冷却温度为4～10℃。
[0027]
具体的，c步骤中95％浓度的乙醇加入量为浓缩液体积的1.5～2倍。
[0028]
具体的，d步骤中精制工序是，将胞苷粗品加入纯水中，溶解后加入活性炭脱色，过滤，向滤液中加入1.5～2倍体积的95％浓度的乙醇，在0～10℃下结晶，过滤分离，固体真空干燥后即得胞苷精品。
[0029]
其中a步骤中发生的酶法合成胞苷反应式如下：
[0030][0031]
与现有技术相比，本发明有以下有益效果：
[0032]
1、本发明以胞嘧啶和嘌呤核苷为底物，利用酶的专一性一锅法合成胞苷，步骤简单、操作方便；
[0033]
2、本发明工艺为水相、常压、温和反应，环保且安全；
[0034]
3、本发明工艺转化率高，产物容易分离获得，收率高、成本低。
附图说明
[0035]
图1为本发明实施例1提供的胞苷粗品hplc图谱；
[0036]
图2为本发明实施例2提供的胞苷成品hplc图谱。
具体实施方式
[0037]
为了便于理解本发明，下面将本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明的公开内容理解得更加透彻全面。下面结合具体实施方式对本专利的技术方案做进一步详细地说明。
[0038]
实施例1
[0039]
包括以下步骤：
[0040]
a、胞苷的酶催化反应方法：
[0041]
取自来水950ml于2000ml的三口瓶中，加入胞嘧啶50g，肌苷120g，磷酸二氢钠1g，并加热升温至35℃，加入氢氧化钠溶液调ph至7.0，再加入50ml胞苷合成酶hme002酶液，在温度35℃下搅拌反应20h，反应过程中取样进行高效液相色谱(hplc)检测，监控反应进程。hplc检测方法如下：
[0042]
色谱柱：waters atlantis t3 250
×
4.6mm,5μm
[0043]
流动相：100％0.5％kh2po4
[0044]
流速：1.0ml/min
[0045]
检测波长：270nm
[0046]
柱温：30℃
[0047][0048]
b、胞苷酶催化反应终止方法：
[0049]
反应20h后，当hplc监测到酶催化反应转化率》99％时，将a步骤获得的胞苷酶催化反应液加热至90℃，保温搅拌15min，降温至4℃后过滤，滤液进行旋蒸浓缩，浓缩至300ml。
[0050]
c、胞苷反应液后处理粗制方法：
[0051]
将b步骤浓缩液中加入95％浓度的乙醇，乙醇加入量为溶液体积的1.5倍，降温至0℃，保温搅拌过夜后进行过滤分离，获得的固体即胞苷粗品，其hplc纯度》98％。胞苷粗品hplc 图谱如图1所示。
[0052]
d、胞苷的精制方法：
[0053]
将胞苷粗品加纯水重新溶解至200g/l浓度，加入粗品重量1％的活性炭搅拌脱色 30min，过滤后的滤液中加入1.5倍体积的95％浓度的乙醇，降温至0℃，保温搅拌过夜后进行过滤分离，得到的白色固体进行真空干燥，即获得胞苷成品，共计99g。胞苷成品的 hplc纯度》99％，总收率》90％。胞苷成品hplc图谱如图2所示。
[0054]
实施例2
[0055]
在实施例1中a步骤中使用的胞苷合成酶hme002的制备方法，如下：
[0056]
将hm002菌株(来自深圳华酶生物科技有限公司实验室)的单菌落接种到5ml液体lb 培养基中，在37℃下振荡培养12h后，以1％的接种量转接于500ml新鲜液体lb培养基中，在37℃下振荡培养至od600值达到0.5时，加入终浓度为1mm的iptg诱导剂，再置于37℃下振荡诱导16h；诱导结束后将培养液于8000rpm下离心10min收集细胞，加入50ml ph7.0 的50mm pbs缓冲液重悬细胞，将重悬的细胞液置于冰浴中进行超声破碎细胞，将破碎液于8000rpm下离心10min，收集上清液即得到用于合成胞苷的酶hme002。
[0057]
实施例3
[0058]
基于实施例1，在实施例1中a步骤中胞苷的酶催化反应还可以采用以下方法：
[0059]
取自来水950ml于2000ml的三口瓶中，加入胞嘧啶50g，腺苷120g，磷酸二氢钠1g，升温至35℃后，氢氧化钠溶液调ph至7.0后加入50ml实施例2中制备的hme002酶液， 35℃下搅拌反应20h，反应过程中取样高效液相色谱(hplc)检测，监控反应进程。hplc 检测方法如下：
[0060]
色谱柱：waters atlantis t3 250
×
4.6mm,5μm
[0061]
流动相：a：0.5％kh2po4 b：甲醇；a：b＝95：5
[0062]
流速：1.0ml/min
[0063]
检测波长：270nm
[0064]
柱温：30℃
[0065][0066]
20h后取样hplc检测，转化率95％以上，反应结束。反应液加热至90℃，保温搅拌 15min，降温至4℃后过滤，滤液进行旋蒸浓缩，浓缩至300ml。浓缩液中加入95％浓度的乙醇，乙醇加入量为溶液体积的1.5倍，降温至0℃，保温搅拌过夜后进行过滤分离，获得的固体即胞苷粗品，其hplc纯度》95％。胞苷粗品加纯水重新溶解至200g/l浓度，加入粗品重量1％的活性炭搅拌脱色30min，过滤后的滤液中加入1.5倍体积的95％浓度的乙醇，降温至0℃，保温搅拌过夜后进行过滤分离，得到的白色固体进行真空干燥，即获得胞苷成品，共计93g。胞苷成品的hplc纯度》97％，总收率》85％。
[0067]
实施例4
[0068]
取自来水950ml于2000ml的三口瓶中，加入胞嘧啶50g，鸟苷125g，磷酸二氢钠1g，升温至35℃后，氢氧化钠溶液调ph至7.0后加入50ml实施例2中制备的hme002酶液， 35℃下搅拌反应20h，反应过程中取样高效液相色谱(hplc)检测，监控反应进程。hplc 检测方法如下：
[0069]
色谱柱：waters atlantis t3 250
×
4.6mm,5μm
[0070]
流动相：100％0.5％kh2po4
[0071]
流速：1.0ml/min
[0072]
检测波长：270nm
[0073]
柱温：30℃
[0074][0075]
20h后取样hplc检测，转化率98％以上，反应结束。反应液加热至90℃，保温搅拌 15min，降温至4℃后过滤，滤液进行旋蒸浓缩，浓缩至300ml。浓缩液中加入95％浓度的乙醇，乙醇加入量为溶液体积的1.5倍，降温至0℃，保温搅拌过夜后进行过滤分离，获得的固体即胞苷粗品，其hplc纯度》98％。胞苷粗品加纯水重新溶解至200g/l浓度，加入粗品重量1％的活性炭搅拌脱色30min，过滤后的滤液中加入1.5倍体积的95％浓度的乙醇，降温至0℃，保温搅拌过夜后进行过滤分离，得到的白色固体进行真空干燥，即获得胞苷成品，共计98g。胞苷成品的hplc纯度》99％，总收率》89％。
[0076]
实施例5
[0077]
基于实施例1，在实施例1中a步骤中胞苷的酶催化反应还可以采用以下方法：
[0078]
取自来水950ml于2000ml的三口瓶中，加入胞嘧啶50g，黄嘌呤核苷125g，磷酸二氢
钠1g，升温至35℃后，氢氧化钠溶液调ph至7.0后加入50ml实施例2中制备的hme002 酶液，35℃下搅拌反应20h，反应过程中取样高效液相色谱(hplc)检测，监控反应进程。 hplc检测方法如下：
[0079]
色谱柱：waters atlantis t3 250
×
4.6mm,5μm
[0080]
流动相：100％0.5％kh2po4
[0081]
流速：1.0ml/min
[0082]
检测波长：270nm
[0083]
柱温：30℃
[0084][0085]
20h后取样hplc检测，转化率90％以上，反应结束。反应液加热至90℃，保温搅拌 15min，降温至4℃后过滤，滤液进行旋蒸浓缩，浓缩至300ml。浓缩液中加入95％浓度的乙醇，乙醇加入量为溶液体积的1.5倍，降温至0℃，保温搅拌过夜后进行过滤分离，获得的固体即胞苷粗品，其hplc纯度》90％。胞苷粗品加纯水重新溶解至200g/l浓度，加入粗品重量1％的活性炭搅拌脱色30min，过滤后的滤液中加入1.5倍体积的95％浓度的乙醇，降温至0℃，保温搅拌过夜后进行过滤分离，得到的白色固体进行真空干燥，即获得胞苷成品，共计82g。胞苷成品的hplc纯度》92％，总收率》75％。
[0086]
实施例6
[0087]
基于实施例1，在实施例1中b步骤还可以采用以下方法：
[0088]
反应20h后，当hplc监测到酶催化反应转化率》99％时，将反应液加热至70℃，保温搅拌30min，降温至10℃后进行过滤，滤液进行旋蒸浓缩，浓缩至300ml。
[0089]
实施例7
[0090]
基于实施例1，在实施例1中c步骤还可以采用以下方法：
[0091]
将步骤b中浓缩液加入95％浓度的乙醇，乙醇加入量为溶液体积的2倍，降温至10℃，保温搅拌过夜后进行过滤分离，获得的固体即为胞苷粗品。
[0092]
实施例8
[0093]
基于实施例1，在实施例1中d步骤还可以采用以下方法：
[0094]
将胞苷粗品加纯水重新溶解至300g/l浓度，加入粗品重量0.5％的活性炭搅拌脱色1h 后过滤，滤液加入2倍体积的95％浓度的乙醇，降温至10℃，保温搅拌过夜后进行过滤分离，获得的白色固体真空干燥后即得胞苷成品。
[0095]
需要说明的是，上述实施例1的a步骤中，胞苷的酶催化反应方法，按照顺序，升温至35℃还可以替换为35～40℃之间的任意值；调ph值至7.0还可以替换为ph7.0～8.0之间的任意值，反应20h还可以替换为16～20h之间的任意值。
[0096]
需要说明的是，上述实施例2中胞苷合成酶hme002的制备，按照顺序，37℃还可以替换为35～40℃之间的任意值；振荡12h还可以替换为6～16h之间的任意值；1％的接种量
还可以替换为0.5～2％之间的任意值；od600值0.5还可以替换为0.4～0.8之间的任意值；诱导剂iptg终浓度0.5mm还可以替换为0.4～1mm；37℃还可以替换为30～37℃之间的任意值；振荡诱导16h还可以替换为8～20h之间的任意值；8000rpm离心还可以替换为 7000～10000rpm之间的任意值；离心10min还可以替换为10～30min之间的任意值。
[0097]
需要说明的是，上述实施例1的b步骤，按照顺序，加热至90℃还可以替换为70～90℃之间的任意值；搅拌15min还可以替换为15～30min之间的任意值；降温至4℃还可以替换为4～10℃之间的任意值。
[0098]
需要说明的是，上述实施例1中c步骤，按照顺序，95％乙醇加量为浓液体积的1.5 倍还可以替换为1.5～2倍之间的任意值；降温至0℃还可以替换为0℃～10℃之间的任意值。
[0099]
需要说明的是，上述实施例1中d步骤，按照顺序，粗品溶解浓度200g/l还可以替换为200g/l～300g/l之间的任意值；活性炭的加量为粗品重量的1％还可以替换为0.5％～1％之间的任意值；脱色30min还可以替换为30min～1h之间的任意值；95％乙醇加量为液体体积的1.5倍还可以替换为1.5～2倍之间的任意值；降温至0℃还可以替换为0℃～10℃之间的任意值。
[0100]
综上所述，本发明的酶法合成胞苷工艺反应步骤简单、操作方便、转化率高、收率高，可大幅降低生产成本，并且制备过程中产生的三废很少，非常绿色环保，较适用于产业化生产。
[0101]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来讲，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变动或变化。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申的显而易见的变动或变化仍处于本发明创造的保护范围之中。