多重基因组编辑

背景技术：

1、经由序列特异性核酸酶的基因组编辑是已知的。基因组中核酸酶介导的双链dna(dsdna)断裂可以通过两种主要机制修复：非同源性末端连接(nhej) 或同源定相修复(hdr)，所述nhej常常导致导入非特异性的插入和缺失(插入缺失)，所述hdr纳入同源性链作为修复模板。参见参考文献4，通过引用其全文纳入本文。当序列特异性核酸酶与包含所需突变的同源供体dna构建体一起递送时，基因靶向效率相较于仅仅只有供体构建体的情况增强了1000倍。

2、已经研发了替代性方法来使基因组修饰的过程加速，该方法通过直接将位点特异性核酸酶的dna或mrna注入一个细胞胚胎以在不同物种的特定基因座生成dna双链断裂(dsb)。然后，通过这些位点特异性核酸酶诱导的dsb 可以通过易错非同源性末端连接(nhej)被修复，获得在切割位点携带缺失或插入的突变小鼠和大鼠。如果用与侧接dsb的末端具有同源性的供体质粒共同注入，那么高保真同源性重组可以产生具有靶向整合的动物。因为这些方法需要针对各靶基因对锌指核酸酶(znf)或转录激活物样效应物核酸酶(talen)进行复杂设计，并且因为靶向的效率可能会显著变化，所以至今尚未报道多重基因靶向。

3、因此，需要用于生产遗传修饰的细胞以生成动物(如猪)的改进方法，以用作器官移植潜在的器官来源。

技术实现思路

1、本文描述了成簇且规律间隔的短回文重复序列(crispr)和crispr相关 (cas)蛋白(crispr/cas)系统的应用，以实现细胞中多重核酸序列的高效且同时靶向。

2、本公开的方面涉及细胞(例如，干细胞、体细胞、生殖细胞、受精卵)中的基因组dna修饰，如dna的多重修饰，其中使用一个或多个向导rna(核糖核酸)来将由所述细胞表达的具有核酸酶活性的酶(如具有核酶活性的dna结合蛋白)导向至dna(脱氧核糖核酸)上的靶位置，其中所述酶切割dna，并且外源性供体核酸(诸如通过同源性重组)插入该dna中。本公开的方面包括细胞中dna修饰的循环和重复步骤以产生在这样的细胞内具有多重dna修饰的细胞。修饰可以包括外源性供体核酸的插入。修饰可以包括内源性核酸的缺失。

3、通过向细胞进行导入的单一步骤(如通过共转染)，可以对多个核酸序列进行调节(例如，使其失活)，其中所述细胞表达酶，和编码多个rna的核酸，其中所述rna被，并且其中多个rna中的每一个将所述酶导向至dna的特定位点，所述酶切割dna。根据该方面，细胞中dna的许多改变或修饰是在但单个循环中产生的。

4、根据一个方面，表达所述酶的细胞已经被遗传改变以表达所述酶，如通过向该细胞导入编码该酶并且可以使其通过该细胞表达的核酸。以此方式，本公开的方面包括循环这样步骤：向表达所述酶的细胞中导入rna，向该细胞中导入外源性供体核酸，使该rna表达，形成rna、所述酶和dna的共定位复合物，并且通过该酶对dna进行酶切。本文还提供了供体核酸向dna中的插入。上述步骤的循环或重复导致细胞在多个基因座处的多重遗传修饰，即，具有多个遗传修饰的细胞。

5、根据某些方面，本发明范围内的dna结合蛋白或酶包括与向导rna形成复合物的蛋白质，并且向导rna将复合物导向到双链dna序列，其中所述复合物结合至该dna序列。根据一个方面，酶可以是rna引导的dna结合蛋白，如ii型crispr系统的rna引导的dna结合蛋白，其结合dna并且通过rna引导。根据一个方面，rna引导的dna结合蛋白是cas9蛋白。

6、本发明的这一方面可被称为rna和dna结合蛋白向或与双链dna的共定位。以此方式，dna结合蛋白引导的rna复合物可以用于切割双链dna 的多个位点，从而产生具有多个遗传修饰的细胞，所述遗传修饰如对基因的一个或多个(例如，全部)拷贝的破坏。

7、根据某些方面，提供了一种在表达这样酶的细胞中对靶dna产生多个改变的方法，所述酶与和靶dna互补的rna形成共定位复合物并且以位点特异性的方式切割靶dna，所述方法包括(a)向该细胞导入第一外来核酸，其编码与靶dna互补的一个或多个rna并且将所述酶引导至靶dna，其中一个或多个rna和所述酶是针对靶dna的共定位复合物的成员，其中一个或多个 rna和所述酶共定位至靶dna，所述酶切割靶dna以在细胞中产生改变的 dna，并且重复步骤(a)数次以产生所述细胞中的dna的多个改变。

8、在一些方面，使细胞中一个或多个靶核酸序列的表达失活的方法包括，向细胞导入一个或多个核糖核酸(rna)序列和编码cas蛋白的核酸序列，所述 rna序列包括与一个或多个靶核酸序列中各靶核酸序列的全部或部分互补的部分；并且，将该细胞维持在这样的条件下，cas蛋白在该条件下表达，并且所述cas蛋白结合该细胞中一个或多个靶核酸序列并使该一个或多个靶核酸序列失活。

9、在其他方面，调节细胞中一个或多个靶核酸序列的方法包括，向该细胞导入这样的核酸序列，其编码与该细胞中靶核酸序列的全部或部分互补的rna；向该细胞中导入这样的核酸序列，其编码与该rna相互作用并且以位点特异性的方式切割该靶核酸序列的酶；并且将该细胞维持在这样的条件下，在所述条件下所述rna结合互补靶核酸序列，形成复合物，并且其中该酶结合该复合物上的结合位点，并且调节一个或多个靶核酸序列。

10、在本文所述的方法中，导入步骤可以包括用一个或多个rna序列以及编码cas蛋白的核酸序列转染细胞。

11、在一些实施方式中，将一个或多个rna序列、编码cas蛋白的核酸序列、或其组合导入细胞的基因组中。

12、在一些实施方式中，cas蛋白的表达是诱导型的。

13、在本文所述的方法中，本文的细胞来自胚胎。细胞可以是干细胞、受精卵、或生殖细胞。在细胞是干细胞的实施方式中，干细胞是胚胎干细胞或多能干细胞。在其它实施方案中，细胞是体细胞。在细胞是体细胞的实施方式中，体细胞是真核细胞或原核细胞。真核细胞可以是动物细胞，如来自猪、小鼠、大鼠、兔、狗、马、牛、非人灵长类动物、人。

14、一个或多个靶核酸序列可以包括猪内源性逆转录病毒(perv)基因。例如， perv基因可以包括pol基因。

15、本文所述方法可以灭活、调节或影响pol基因的一个或多个拷贝。在一些实施方式中，细胞中pol基因的全部拷贝失活。

16、在一些实施方式中，cas蛋白是cas9。

17、在一些实施方式中，一个或多个rna序列可以是约10-约1000个核苷酸。例如，一个或多个rna序列可以是约15-约1000个核苷酸。

18、在一些方面，工程改造的细胞包括一个或多个内源性病毒基因；以及一个或多个外源性核酸序列，所述外源性核酸序列包含与该一个或多个内源性病毒基因的一个或多个靶核酸序列的全部或部分互补的部分；其中，细胞的一个或多个内源性病毒基因中的每一个都被调节。

19、在另一方面，工程改造的细胞包括多个内源性逆转录病毒基因；以及一个或多个外源性核酸序列，所述外源性核酸序列包含与该多个内源性逆转录病毒基因的一个或多个靶核酸序列的全部或部分互补的部分；其中，细胞的多个内源性病毒基因中的每一个都被调节。

20、本文所述的工程改造的细胞可以包括猪内源性逆转录病毒(perv)基因。例如，perv基因可以包括pol基因。

21、在一些方面，pol基因的调节使pol基因的一个或多个拷贝被灭活。例如，细胞中pol基因的全部或基本全部拷贝被灭活。

22、根据一个方面，该rna在约10至约1000个核苷酸之间。根据一个方面，该rna在约20至约100个核苷酸之间。

23、根据一个方面，一个或多个rna是向导rna。根据一个方面，一个或多个rna是tracrrna-crrna融合体。

24、根据一个方面，dna是基因组dna、线粒体dna、病毒dna、或外源性dna。