一种检测外膜囊泡的荧光探针及其应用

1.本发明属于检测技术领域，目的是开发一种能够用于omv研究的荧光探针，本发明荧光探针采用具有下式生色团的化合物，并将其应用于omv检测。


背景技术：

2.外膜囊泡(omv)大多是由革兰氏阴性菌产生的球状凸起。omv中负载了包括脂多糖，鞭毛蛋白，肽聚糖，酶，dna，rna等生物分子。这些生物分子使得omv能够参与到很多重要的生物过程，包括细菌致病性，信息传递，群体感应，水平基因传递和对压力环境的反应。此外omv在调控宿主的免疫中也有很重要的作用，因此可以通过调节omv来诱导产生免疫，进而被应用于疫苗的助剂。omv在开发癌症疫苗和癌症的免疫疗法中也具有很重要的意义。
3.omv的尺寸在20-250nm。如此小的尺寸使得实验中观察omv非常的困难。
4.目前在omv的研究中，通常采用蛋白质组学(1)和粒子追踪技术(2)。但是这两种技术需要冗长的差速离心或者超滤，使得omv的研究非常困难(3-5)。
5.荧光技术具有良好的灵敏性，但是目前大多数荧光在溶液态具有很强的荧光，因而在研究omv的过程中产生很强的背景。这种强的背景使得对omv的定量分析非常困难，也降低了分析的灵敏性。
6.参考文献：
7.1.w.elhenawy，m.o.debelyy，m.f.feldman，mbio 2014，5，e00909-00914.
8.2.m.j.h.gerritzen，d.e.martens，r.h.wijffels，m.stork，j.extracell.vesicles 2017，6，1333883.
9.3.r.dehinwal，d.cooley，a.v.rakov，a.s.alμgupalli，j.harmon，o.cunrath，p.vallabhajosyula，d.bμmann，d.m.schifferli，mbio 2021，12，e0086921；
10.4.a.j.manning，m.j.kuehn，bmc microbiol.2011，11，258；
11.5.a.bauwens，l.kunsmann，h.karch，a.mellmann，m.bielaszewska，antimcrob.agents chemother.2017，61，e00937-00917.


技术实现要素：

12.鉴于现有技术存在的问题，本发明的目的是开发一种能够用于omv研究的荧光探针。该荧光探针具有低荧光背景，在结合omv后其荧光增强，能够灵敏的检测omv的生成，并对高通量的筛选能够诱导omv产生的因素。
13.一种检测外膜囊泡的荧光探针，采用具有下式生色团的化合物，并将其应用于外膜囊泡(omv)检测，
[0014][0015]
其中a1，a2，a3，a4独立选自并且a1，a2，a3，a4中至少一个为至少一个为
[0016]
其中a1，a2，a3，a4可以相同，也可以不同；
[0017]
其中n在0-100，优选1-50，更优选1-10；
[0018]
r1，r2可以相同也可以不同，它们可以是任何阴离子，包括氟离子，氯离子，溴离子，碘离子，六氟磷酸根粒子，乙酸根离子等等。改变阴离子不影响本发明的保护内容。
[0019]
作为本发明的一种优选技术方案，所述化合物选自该化合物相对于其他可作为荧光探针的化合物具有低荧光背景，在结合omv后其荧光增强，能够灵敏的检测omv的生成。
[0020]
作为本发明的一种优选技术方案，这些化合物溶液中荧光很弱，或者不发射荧光。
[0021]
作为本发明的一种优选技术方案，这些化合物在缓冲液或mops培养液中不发光或者发出微弱的光。
[0022]
作为本发明的一种优选技术方案，当用这些化合物在缓冲液或者mops培养液中对革兰氏阴性菌染色的时候，革兰氏阴性菌不发光或者发出很弱的光。
[0023]
作为本发明的一种优选技术方案，当革兰氏阴性菌在刺激条件下，包括化学物质刺激，温度刺激，物理刺激等等，产生omv时，用这些化合物孵育可以使得溶液的荧光增强。
[0024]
作为本发明的一种优选技术方案，化学物质刺激包括抗生素刺激，包括但不限于氨苄霉素、卡纳霉素、氨曲南、氯霉素。
[0025]
作为本发明的一种优选技术方案，这些化合物结合到omv时，其荧光会增强。
[0026]
作为本发明的一种优选技术方案，分泌omv的革兰氏阴性菌也会被这些化合物结合，荧光增强。
[0027]
作为本发明的一种优选技术方案，这些化合物使用的浓度范围在0.01微摩尔到10毫摩尔。优选0.1微摩尔到1毫摩尔。更优选1微摩尔到500微摩尔。
[0028]
作为本发明的一种优选技术方案，对产生omv的革兰氏阴性菌的种类没有限制。
[0029]
作为本发明的一种优选技术方案，革兰氏阴性菌选自ecn(e.coli nissle 1917)。
4.03(m，2h，alkyl)，3.80-3.77(m，2h，alkyl)，3.68-3.49(m，11h，alkyl)，3.20(s，9h，alkyl)，2.60-2.52(m，2h，alkyl)，1.89ppm(s，6h，alkyl)；
13
c nmr(125mhz，cd3od)：δ(tms，ppm)180.05(rcoo)，159.18，159.08，156.23，145.57，145.44，145.36，145.30，145.24，144.40，143.34，142.65，141.05，138.91，137.58，135.37，133.69，133.65，133.20，132.51，132.46，130.18，128.95，128.90，128.85，128.76，128.45，127.75，127.59，127.27，127.19，125.49，123.59，115.03，114.88(ar)，72.99，72.97，71.76，71.59，71.42，71.40，70.85，68.53，63.91，59.13，58.14，53.94，26.00，24.24(alkyl).hrms(esi-q-tof，m/z)calcd for(c
52h58
n2o
42+
)[(m-2(ch3coo))
2+
]387.2193，found 387.2167.
[0046]
实施例2
[0047]
将实施例1的化合物otm加入到含有ecn(e.coli nissle 1917)的不同培养物中时的荧光情况：
[0048]
具体结果参照图1.不同条件下otm的荧光强度变化，图中od
600
代表ecn(e.coli nissle 1917)的浓度。
[0049]
1.ecn(37℃ mops培养基)培养5小时后，在10μmol/l的otm存在时的荧光照片；
[0050]
2.ecn在1μg/ml的氨苄霉素条件下培养5小时后，在10μmol/l的otm存在时的荧光照片；
[0051]
3.ecn在1μg/ml的氨苄霉素条件下培养5小时后，去上清液，菌体部分重新分散后，在10μmol/l的化合物存在时的荧光照片；
[0052]
4.ecn在1μg/ml的氨苄霉素条件下培养5小时后，上清液在10μmol/l的化合物存在时的荧光照片；
[0053]
5.仅有氨苄霉素时，在10μmol/l的化合物存在时的荧光照片。
[0054]
实验表明，氨苄霉素诱导omv产生，omv在上清液中，上清液发射荧光。
[0055]
图1中，2中既包含上清，也包含菌体，所以荧光最强，3中包含菌体，产生omv后菌体结构改变，荧光也会增强；4.上清中omv存在结合到探针，导致荧光比5中要明显增强。
[0056]
实施例2
[0057]
将实施例1的化合物otm加入到含有ecn(e.coli nissle 1917)的不同浓度的抗生素条件下中时的荧光情况：
[0058]
具体结果参照图2.ecn(37℃ mops培养基)在不同浓度的抗生素条件下培养5小时后，在10μmol/l的otm存在时的相对荧光强度。
[0059]
其中，i0是没有抗生素，ecn培养五小时后，加入10μmol/l的otm的荧光强度；i是在不同浓度抗生素存在时，ecn培养五小时后，加入10μmol/l的otm的荧光强度；id是只有mops培养基的时候，10μmol/l的otm的荧光强度。
[0060]
如图2所示，氨苄霉素浓度范围在0.25-5μg/ml相对于卡纳霉素能够更高效的更高效的诱导产生omv，说明本发明荧光探针能够快速的鉴别在抗生素诱导的情况。
[0061]
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。