一种单克隆鉴定试剂盒及鉴定单克隆细胞基因型的方法与流程

1.本发明涉及细胞基因型鉴定技术领域，尤其涉及一种单克隆鉴定试剂盒及鉴定单克隆细胞基因型的方法。


背景技术：

2.基因编辑(gene editing)，又称基因组编辑(genome editing)或基因组工程(genome engineering)，是一种新兴的比较精确的能对生物体基因组特定目标基因进行修饰的一种基因工程技术，基因编辑是指人工对基因组进行修饰，使其遗传信息改变的工程，包括基因敲除，点突变和敲入，基因编辑以其能够高效率地进行定点基因组编辑，在基因研究、基因治疗和遗传改良等方面展示出了巨大的潜力。
3.在细胞上进行基因编辑，所获得的细胞株为基因编辑细胞株，通常为单克隆细胞株，即由单个细胞增殖形成的细胞团，制备得到单克隆细胞株后需要对单克隆细胞株的基因型进行鉴定，以确定该单克隆是否为要筛选的阳性克隆。单克隆鉴定是基因编辑细胞株流程中的重要环节，目前，对鉴定单克隆细胞株的基因型的传统方法需要提取基因组dna，并需要进行多步骤的提取纯化处理，使得操作繁琐，耗时较长，工作量大，且难以实现高通量鉴定。


技术实现要素：

4.针对背景技术提出的问题，本发明的目的在于提出一种单克隆鉴定试剂盒，采用本发明的单克隆鉴定试剂盒进行鉴定，可以直接释放细胞的基因组dna，并用于单克隆细胞株的基因型鉴定，不需要进行多步骤的提取纯化处理，且能批量快速地提取上百个单克隆细胞的基因组，可以实现高通量鉴定，解决了现有鉴定单克隆细胞株需要进行多步骤的提取纯化处理和难以实现高通量鉴定的问题。
5.本发明的另一目的在于提出一种鉴定单克隆细胞基因型的方法，使用上述的单克隆鉴定试剂盒，具有操作步骤简单和耗时短的优点，且能批量快速地提取上百个单克隆细胞的基因组，可以实现实现高通量鉴定，解决了现有鉴定单克隆细胞株需要进行多步骤的提取纯化处理和难以实现高通量鉴定的问题。
6.为达此目的，本发明采用以下技术方案：
7.一种单克隆鉴定试剂盒，包括单克隆细胞裂解液、单克隆细胞基因扩增试剂和内参引物；
8.所述单克隆细胞裂解液包括裂解液a和裂解液b，所述裂解液a的组分包括氢氧化钠和十二烷基硫酸钠；所述裂解液b的组分包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钾和乙二胺四乙酸；
9.所述内参引物序列对为：正向引物-tcaaggtcagcgctcggac，反向引物-cggttgcaacatggcggc。
10.进一步的，按质量百分数，所述裂解液a包括5～200mm的氢氧化钠，且按质量百分
数计算，所述裂解液a还包括0.05％～1％的十二烷基硫酸钠。
11.进一步的，所述裂解液b包括5～500mm的三羟甲基氨基甲烷、10～1000mm的氯化钾和1～100mm的乙二胺四乙酸；
12.优选的，所述裂解液b的ph值为7.0～9.0。
13.进一步的，所述单克隆细胞基因扩增试剂为mightyamp
tm dna polymerase ver.2。
14.一种鉴定单克隆细胞基因型的方法，采用上述的单克隆鉴定试剂盒，包括以下方法：
15.(1)细胞裂解：在单克隆细胞样品中加入裂解液a，吹打混匀，将单克隆细胞样品转移至pcr板，盖上硅胶膜，pcr仪设置好程序，95℃，10min，单克隆细胞样品上机；
16.(2)终止裂解：从pcr仪上取下裂解好的单克隆细胞样品，加入裂解液b，吹打混匀，得到单克隆细胞裂解产物；
17.(3)配制pcr体系1和pcr体系2，并设置好pcr仪的上机程序后，上机；之后，分别将pcr体系1和pcr体系2获得的产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过琼脂糖凝胶电泳的结果判断单克隆细胞的基因型；
18.所述pcr体系1的组分包括单克隆细胞基因扩增试剂、单克隆细胞裂解产物、cd180-f、cd180-r和双蒸水；
19.pcr体系2的组分包括单克隆细胞基因扩增试剂、单克隆细胞裂解产物、内参引物和双蒸水。
20.进一步的，在所述步骤(3)中，所述pcr体系1的组分包括12.5μl的单克隆细胞基因扩增试剂、2μl的单克隆细胞裂解产物、1μl的cd180-f、1μl的cd180-r和8.5μl的双蒸水。
21.进一步的，pcr体系2的组分包括12.5μl的单克隆细胞基因扩增试剂、2μl的单克隆细胞裂解产物、2μl的内参引物和、8.5μl的双蒸水。
22.上述技术方案具有以下有益效果：本技术方案裂解液a的组分包括氢氧化钠和十二烷基硫酸钠，通过裂解液a中的表面活性剂和碱性环境，能够使单克隆细胞的细胞膜裂解，释放细胞基因组dna，同时使细胞内的蛋白酶变性，防止基因组dna降解。同时，裂解液b的组分包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钾和乙二胺四乙酸，裂解液b提供一个适宜的离子环境，可以维持dna的稳定性，有利于长期保存。因此，采用本技术方案的单克隆细胞裂解液，对单克隆细胞进行裂解，可以直接释放细胞的基因组dna，不需要进行多步骤的提取纯化处理，可以直接用于单克隆细胞株的基因型鉴定，同时，采用本方案的单克隆细胞裂解液所获得的基因组dna，稳定性好，可多次使用，长期保存，且能批量快速地提取上百个单克隆细胞的基因组，使得单克隆鉴定环节的通量成10倍～100倍地扩大，可以实现高通量鉴定，从而大大缩短了鉴定时间，因此，采用本技术方案的单克隆鉴定试剂盒，可以解决现有对鉴定单克隆细胞株需要进行多步骤的纯化、操作繁琐、耗时较长、工作量大和难以实现高通量鉴定的问题。
附图说明
23.图1是本发明一个实施例的鉴定单克隆细胞基因型的方法中采用pcr体系1获得的产物进行琼脂糖凝胶电泳后的结果图；
24.图2是图1所示实施例采用pcr体系2获得的产物进行琼脂糖凝胶电泳的结果图。
polymerase ver.2是对mightyamp dna polymerase中的buffer进行改良，可以将血液、动植物组织等生体直接加入到反应液中进行direct pcr，可用单克隆细胞裂解液直接做pcr的酶。mightyamp
tm dna polymerase ver.2对低浓度起始的模板也能进行很好的扩增，对极少量的dna样品进行扩增，以实现单克隆细胞培养初期的快速鉴定。而且，本技术方案的单克隆细胞基因扩增试剂能耐受粗提基因组模板中的各种pcr反应抑制因子，对于gc rich、at rich的模板均可在宽广的模板范围内进行有效扩增，产量高，在模板量极少的情况下，亦可扩增出足够量的基因片段，用于基因型鉴定。
37.一种鉴定单克隆细胞基因型的方法，采用上述的单克隆鉴定试剂盒，包括以下方法：
38.(1)细胞裂解：在单克隆细胞样品中加入裂解液a，吹打混匀，将单克隆细胞样品转移至pcr板，盖上硅胶膜，pcr仪设置好程序，95℃，10min，单克隆细胞样品上机；
39.(2)终止裂解：从pcr仪上取下裂解好的单克隆细胞样品，加入裂解液b，吹打混匀，得到单克隆细胞裂解产物；
40.(3)配制pcr体系1和pcr体系2，并设置好pcr仪的上机程序后，上机；之后，分别将pcr体系1和pcr体系2获得的产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过琼脂糖凝胶电泳的结果判断单克隆细胞的基因型；
41.所述pcr体系1的组分包括单克隆细胞基因扩增试剂、单克隆细胞裂解产物、cd180-f、cd180-r和双蒸水；
42.pcr体系2的组分包括单克隆细胞基因扩增试剂、单克隆细胞裂解产物、内参引物和、双蒸水。
43.值得说明的是，在步骤(1)中，采用本技术方案的裂解液a，对单克隆细胞进行裂解，可以直接释放细胞的基因组dna，不需要进行多步骤的提取纯化处理，可以直接用于单克隆细胞株的基因型鉴定。在步骤(2)中，通过在裂解好的单克隆细胞样品中加入裂解液b，裂解液b为单克隆细胞裂解产物供一个适宜的离子环境，可以维持dna的稳定性，有利于长期保存，本技术方案步骤(1)和步骤(2)的操作步骤简单，时间较短，仅需要15min左右便可，可以实现在96孔板甚至384孔板操作，能够有效提高通量。在步骤(3)中：通过单克隆细胞基因扩增试剂mightyamp dna polymerase ver.2，能兼容粗提取的基因组模板，对极少量的dna样品进行扩增，以实现单克隆细胞培养初期的快速鉴定，同时，提供兼并性内参引物，可用于多个物种细胞的内参基因扩增。
44.具体来说，在进行细胞裂解需要先对细胞进行处理，细胞处理的方法如下：
45.①
贴壁细胞：小心吸走细胞上清，尽量将上清吸取干净。
46.②
悬浮细胞：若悬浮细胞在ep管中，可直接放入小型离心机中，3000rpm常温离心10min，小心吸走上清；若悬浮细胞在96孔细胞培养板中，可将其直接放到台式离心机中3000rpm常温离心10min，小心吸走上清，得到处理好的单克隆细胞样品。
47.③
洗涤细胞(选做)：加pbs洗涤细胞，3000rpm常温离心5-10min，此步骤可减少样品中的杂质，但如果细胞量较少，可不做此步。
48.进一步的说明，在所述步骤(3)中，所述pcr体系1的组分包括12.5μl的单克隆细胞基因扩增试剂、2μl的单克隆细胞裂解产物、1μl的cd180-f、1μl的cd180-r和8.5μl的双蒸水。
49.进一步的说明，pcr体系2的组分包括12.5μl的单克隆细胞基因扩增试剂、2μl的单克隆细胞裂解产物、2μl的内参引物和、8.5μl的双蒸水。
50.下面结合实施例进一步阐述本技术方案。
51.实施例1
52.本实施例单克隆鉴定试剂盒，包括单克隆细胞裂解液、单克隆细胞基因扩增试剂和内参引物；其中，单克隆细胞裂解液包括裂解液a和裂解液b，裂解液a的组分包括100mm的氢氧化钠，且按质量百分数计算，所述裂解液a还包括1％的十二烷基硫酸钠；所述裂解液b包括10mm的三羟甲基氨基甲烷、50mm的氯化钾和10mm的乙二胺四乙酸；
53.单克隆细胞基因扩增试剂为mightyamp
tm dna polymerase ver.2；
54.内参引物为cloneamp ctrl,内参引物的序列对为：正向引物-tcaaggtcagcgctcggac，反向引物-cggttgcaacatggcggc。
55.实施例2
56.本实施例单克隆鉴定试剂盒，包括单克隆细胞裂解液、单克隆细胞基因扩增试剂和内参引物；其中，单克隆细胞裂解液包括裂解液a和裂解液b，裂解液a的组分包括5mm的氢氧化钠，且按质量百分数计算，所述裂解液a还包括0.5％的十二烷基硫酸钠；所述裂解液b包括500mm的三羟甲基氨基甲烷、650mm的氯化钾和1mm的乙二胺四乙酸；
57.单克隆细胞基因扩增试剂为mightyamp
tm dna polymerase ver.2；
58.内参引物为cloneamp ctrl，内参引物的序列对为：正向引物-tcaaggtcagcgctcggac，反向引物-cggttgcaacatggcggc。
59.实施例3
60.本实施例单克隆鉴定试剂盒，包括单克隆细胞裂解液、单克隆细胞基因扩增试剂和内参引物；其中，单克隆细胞裂解液包括裂解液a和裂解液b，裂解液a的组分包括200mm的氢氧化钠，且按质量百分数计算，所述裂解液a还包括1％的十二烷基硫酸钠；所述裂解液b包括5mm的三羟甲基氨基甲烷、10mm的氯化钾和50mm的乙二胺四乙酸；
61.单克隆细胞基因扩增试剂为mightyamp
tm dna polymerase ver.2；
62.内参引物为cloneamp ctrl，内参引物的序列对为：正向引物-tcaaggtcagcgctcggac，反向引物-cggttgcaacatggcggc。
63.实施例4
64.本实施例单克隆鉴定试剂盒，包括单克隆细胞裂解液、单克隆细胞基因扩增试剂和内参引物；其中，单克隆细胞裂解液包括裂解液a和裂解液b，裂解液a的组分包括100mm的氢氧化钠，且按质量百分数计算，所述裂解液a还包括0.05％的十二烷基硫酸钠；所述裂解液b包括400mm的三羟甲基氨基甲烷、1000mm的氯化钾和100mm的乙二胺四乙酸；
65.单克隆细胞基因扩增试剂为mightyamp
tm dna polymerase ver.2；
66.内参引物为cloneamp ctrl，内参引物的序列对为：正向引物-tcaaggtcagcgctcggac，反向引物-cggttgcaacatggcggc。
67.实施例5
68.一种鉴定单克隆细胞基因型的方法，本实施例在鉴定单克隆细胞基因型之前需要对细胞进行处理，细胞处理的操作方法如下：
69.取小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(raw264.7细胞)的cd180基因敲除的单克隆细胞
在96孔长到合适汇合度时，将单克隆细胞消化传代到2个96孔板细胞中，当96孔板细胞贴壁后，取其中1个96孔板的细胞做单克隆鉴定。小心吸走细胞上清，尽量将上清吸取干净，然后悬浮细胞，96孔细胞培养板中的悬浮细胞直接放到台式离心机中3000rpm常温离心10min，小心吸走上清，得到单克隆细胞样品。
70.本实施例鉴定单克隆细胞基因型的方法，采用上述实施例1的单克隆鉴定试剂盒进行鉴定，包括以下步骤：
71.(1)细胞裂解：在每个单克隆细胞样品中加入90μl的裂解液a，吹打混匀15次，将单克隆细胞样品转移至96孔pcr板，盖上硅胶膜，pcr仪设置好程序，95℃，10min，单克隆细胞样品上机；
72.(2)终止裂解：从pcr仪上取下裂解好的单克隆细胞样品，加入10μl的裂解液b，吹打混匀，得到单克隆细胞裂解产物；
73.(3)pcr鉴定：将单克隆细胞基因扩增试剂(mightyamp
tm dna polymerase ver.2)和内参引物(cloneamp ctrl)从-20℃冰箱取出，放置在冰盒中融解，配制pcr体系1和pcr体系2，pcr体系1为扩增实验组，pcr体系2为对照组，pcr体系1和pcr体系2分别如下表1和表2所示：
74.表1 pcr体系1
[0075][0076][0077]
表2 pcr体系1
[0078][0079]
配置好pcr体系1和pcr体系2后，将pcr仪按照如下表3的程序设置好后。
[0080]
表3 pcr仪的上机程序设置
[0081][0082]
将pcr体系1获得的产物取10μl进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，将pcr体系2获得的产物取10μl进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示。图1是小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(raw264.7细胞)cd180基因敲除项目的单克隆初检结果，共筛选到4个阳性克隆(ko理论大小约902bp)，1个杂合克隆(两个条带，ko理论大小约902bp，wt理论大小1284bp)，图2是raw264.7细胞用内参引物cloneamp ctrl进行扩增的结果，条带为335bp，因此可见，采用本技术方案的单克隆鉴定试剂盒，能够高效鉴定单克隆细胞基因型，操作步骤简单，耗时短，在2个小时内可完成单克隆细胞基基因组dna获取，pcr鉴定和凝胶电泳成像整个单克隆基因型鉴定流程。
[0083]
以上结合具体实施例描述了本发明的技术原理。这些描述只是为了解释本发明的原理，而不能以任何方式解释为对本发明保护范围的限制。基于此处的解释，本领域的技术人员不需要付出创造性的劳动即可联想到本发明的其它具体实施方式，这些方式都将落入本发明的保护范围之内。