一种氯苯降解菌及其在污染场地修复中的应用

1.本发明属于微生物处理降解技术领域，涉及一种氯苯降解菌及其在污染场地修复中的应用。


背景技术：

2.氯苯是一种有毒有害的挥发性有机物(vocs)，具有三致作用，已经被美国epa列为优先控制污染物。氯苯是一种重要的中间体和溶剂，广泛应用于农药、塑料和医药等行业。中国是氯苯类化合物最主要的生产国和供应国，占世界产量的50％以上。在土壤和地下水的氯苯污染中，农药厂是主要污染源，吴晓峰等人在山东某农药厂污染地下水中检出氯苯最高超标7倍，王海平等人在某农药厂污染地下水检出氯苯37.4mg/l，陈莉娜等人在某有机氯农药厂检出氯苯5.62mg/l。另外，在一些在产企业场地也常氯苯检出，沈宗泽等人在北方某化工厂污染地块地下水中检出氯苯600-1200μg/l，xu等人在中国某溶剂处理厂的土壤和地下水中分别检出氯苯13.8-1560mg/kg和1.56mg/l。氯苯对人类和被污染的水生和陆生生态系统周围的其他生物造成了很高的潜在风险和有害影响。
3.近年来，氯苯类化合物的实际场地修复不断开展。顾维等人利用循环井技术在28d后可以去除地下水中94.5％-96.5％的氯苯，迟克宇等人利用原位电热脱附技术可以去除某退役化学试剂厂土壤及地下水中的氯苯，xie等人利用水电解技术可以去除某废弃化工厂的氯苯污染。但是，这些技术无法满足在产企业的场地修复要求。在产场地修复要避免影响正常生产，要充分保障安全，要防止污染物反弹，因此，因此有必要选择一种安全、高效、连续的原位修复方法。微生物修复因其灵活性、高效性、有效性、经济性和生态友好性而成为较好的选择。
4.利用微生物来降解氯苯及氯苯类化合物在国内外已有很多报道，并筛选出大量对氯苯有很好降解作用的微生物。张丽丽等人从生物滴滤床中筛选到皮氏罗尔斯顿菌h2(专利号cn 101880642 a)，欧阳杜娟等人从活性污泥中筛选到吡啶红球菌(专利号cn 110982728 a)。而这些菌株虽然能够降解氯苯，但针对农药、化工等氯苯污染地下水具有温度低、污染物种类多造成降解菌难存活和活性低的问题，研发具有生长温度范围广、降解底物多的氯苯高效降解菌株尚未报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的就是为了提供一种氯苯降解菌及其应用，以克服现有其它菌种降解速度慢、对低浓度氯苯污染物去除不够彻底，并且容易造成二次污染等问题中的至少一种。
6.本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
7.一方面，本发明提出了一种氯苯降解菌，其为潘多拉杆菌属，命名为pandoraea sp.xjj-1，保藏于中国典型培养物保藏中心(地址为中国.武汉.武汉大学)，保藏编号为cctcc no：m 2021057，保藏时间为2021年1月14日。
8.进一步的，其革兰氏染色呈阴性，菌株形态无荚膜、杆菌，且在luria-bertani培养
基上菌落形态规则，呈黄色、凸起、不透明和光滑。同时，对其进行了16s rdna测序，所测得的16s rdna序列如seq id no.1所示，并将16s rdna序列进行blast比对，比对结果显示，菌株xjj-1的16s rdna的核苷酸序列与潘多拉杆菌属(pandoraea sp.)不同菌株的核苷酸序列有大于99％的同源性。
9.另一方面，本发明还提出了一种氯苯降解菌的筛选方法，包括以下步骤：
10.(1)将基础无机盐培养基、微量元素混合液和氯苯溶液混合，得到液体培养基；
11.(2)称取一定质量的农药厂污染土壤样品放置于液体培养基中，恒温摇床培养后得到含有菌的第一培养液，移取10％的第一培养液(此处为体积量)转移至另一份液体培养基中，培养后得到含有菌的第二培养液，如此重复多次，直至得到第n培养液，其中n＝5-8；
12.(3)将所得第n培养液进行涂布稀释划线分离培养，即得到氯苯降解菌。
13.进一步的，步骤(1)中，所述的基础无机盐培养基中的无机盐成分至少包含：0.023g/l cacl2；0.2g/l mgso4·
7h2o；2.5g/l(nh4)2so4；1.0g/l kh2po4；4.5g/l na2hpo4·
12h2o。
14.进一步的，步骤(1)中，所述的微量元素混合液中的溶质成分至少包括：0.15g/l znso4·
7h2o，0.26g/l mnso4·
h2o，0.03g/l cocl2·
6h2o，4.5g/l feso4·
7h2o，0.02g/l nicl2·
6h2o，0.01g/l cucl2，0.1g/l na2moo4·
2h2o，0.06g/l h3bo3。
15.进一步的，步骤(1)中，氯苯溶液所用的溶剂为n,n-二甲基甲酰胺，其浓度优选为50g/l；
16.无机盐培养基、微量元素溶液、氯苯溶液的添加体积比为106:103:2。
17.进一步的，这里从农药厂获得的土壤样品和液体培养基的用量可以根据实际要求进行调节。例如，步骤(2)中，制得第一培养液时，土壤样品与液体培养基的添加量之比可以为(3-6)g:30ml。同样的，从第一培养液中转移至第二培养液的量与第一混合液体积比可以是1:30至1:10，本发明不局限于此。
18.进一步的，步骤(2)的整个驯化过程中，所用工具可以根据实际情况具体选择，这里筛选所用的瓶子为150ml钳口血清瓶，用铝盖加垫片密封，其中所加液体为20-30ml，当然，本发明不局限于此。
19.进一步的，步骤(2)中，驯化条件可以根据实际情况具体选择。比如，这里适用的摇床转速可以是180r/min，培养过程在密闭条件下进行，温度为28℃，每次培养的时间为2-3d。
20.进一步的，步骤(3)中，稀释涂布分离培养过程具体为：取1ml第n次培养液，用磷酸缓冲液逐级稀释为10-1
，10-2
，10-3
，10-4
，10-5
，10-6
，每个浓度梯度吸取100μl液体后转移至含有氯苯的luria-bertani培养基平板中，用涂步棒进行涂布分离，每个梯度3个平行。培养一定时间后，用接种环挑取合适的单菌落在luria-bertani培养基平板上线分离，如此重复2-3次，将获得的单菌接种至含有氯苯的无机盐培养基中验证降解能力，若观察到氯苯浓度降低且细菌能以氯苯为唯一碳源生长，即为氯苯降解菌。
21.再另一方面，本发明还提出了一种氯苯降解菌的应用，具体的，将其应用在降解氯苯中。更具体的，该氯苯降解菌用于修复氯苯污染场地，优选的，所述氯苯污染场地为氯苯污染土壤或氯苯污染地下水。同时，该氯苯降解菌修复氯苯污染场地时的温度可以为10～37℃。具体的，可以为10～15℃。此外，该氯苯降解菌用于降解氯苯、苯、甲苯及乙苯。
22.本发明提供的氯苯降解菌是pandoraea sp.xjj-1，16s rdna序列genbank登录号为mw453096，保藏编号为cctcc no：m 2021057。所述筛选方法包括：从农药厂周边污染土壤样品中，经驯化、分离和纯化后得到。本发明通过从农药厂周围提取污染土壤，并从中筛选出氯苯降解菌xjj-1，该菌不仅能高效降解氯苯，对苯、甲苯、乙苯和二甲苯也有较好的降解效果。通过上述氯苯降解菌xjj-1对水中的氯苯进行降解，能达到去除污染物的目的，并且中间产物被彻底降解。该操作成本较低，对环境产生的负面影响小，具有很好的开发利用前景。
23.本发明的有益效果主要体现在：在某农药厂污染土壤中筛选出一株氯苯高效降解菌，具有良好的ph和温度适应性，可以耐受高达600mg/l氯苯，在11h可以完全降解100mg/l氯苯。同时该菌能够高效降解苯、甲苯、乙苯等苯系物，具有一定的底物广谱性。相较于现有技术，本发明提供的pandoraea sp.xjj-1是一株农药厂污染场地土著菌，并且具有高效的氯苯降解能力，可以在农药厂场地污染修复和在产企业场地风险管控方面发挥重要作用。
附图说明
24.图1为本发明提供的在150ml血清瓶中菌株降解氯苯的过程培养基随时间变浑浊的图片。
25.图2为本发明提供的一种氯苯降解菌株xjj-1的菌落形态图。
26.图3为本发明提供的一种氯苯降解菌株xjj-1的扫描电镜图。
27.图4为本发明中提供的一种氯苯降解菌株xjj-1的系统发育树。
28.图5为本发明中提供的一种氯苯降解菌株xjj-1的降解特性图。
29.图6为本发明中提供的一种氯苯降解菌株xjj-1降解氯苯的生长曲线和降解曲线图。
30.图7为本发明中提供的一种氯苯降解菌株xjj-1降解氯苯过程的hplc色谱图。
31.图8为本发明中提供的一种氯苯降解菌株xjj-1的氯苯代谢途径图。
具体实施方式
32.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
33.特别的，在本文中所披露范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
34.以下各实施例中，如无特别说明的原料或处理技术，即表明其均为本领域的常规市售原料或常规处理技术。
35.一方面，本发明提出了一种氯苯降解菌，其为潘多拉杆菌，菌株代码为xjj-1，保藏于中国典型培养物保藏中心(地址为中国.武汉.武汉大学)，保藏编号为cctcc no：m 2021057，保藏时间为2021年1月14日。
36.进一步的，其革兰氏染色呈阴性，菌株形态无荚膜、杆菌，且在luria-bertani培养
基上菌落形态规则，呈黄色、凸起、不透明和光滑。同时，对其进行了16s rdna测序，所测得的16s rdna序列如seq id no.1所示，并将16s rdna序列进行blast比对，比对结果显示，菌株xjj-1的16s rdna的核苷酸序列与潘多拉杆菌属(pandoraea sp.)不同菌株的核苷酸序列有大于99％的同源性。
37.另一方面，本发明还提出了一种氯苯降解菌的筛选方法，包括以下步骤：
38.(1)将基础无机盐培养基、微量元素混合液和氯苯溶液混合，得到液体培养基；
39.(2)称取一定质量的农药厂污染土壤样品放置于液体培养基中，恒温摇床培养后得到含有菌的第一培养液，移取10％的第一培养液转移至另一份液体培养基中，培养后得到含有菌的第二培养液，如此重复多次，直至得到第n培养液，其中n＝5-8；
40.(3)将所得第n培养液进行涂布稀释划线分离培养，即得到氯苯降解菌。
41.在一些具体的实施方式中，步骤(1)中，所述的基础无机盐培养基中的无机盐成分至少包含：0.023g/l cacl2；0.2g/l mgso4·
7h2o；2.5g/l(nh4)2so4；1.0g/l kh2po4；4.5g/l na2hpo4·
12h2o。
42.在一些具体的实施方式中，步骤(1)中，所述的微量元素混合液中的溶质成分至少包括：0.15g/l znso4·
7h2o，0.26g/l mnso4·
h2o，0.03g/l cocl2·
6h2o，4.5g/l feso4·
7h2o，0.02g/l nicl2·
6h2o，0.01g/l cucl2，0.1g/l na2moo4·
2h2o，0.06g/l h3bo3。
43.在一些具体的实施方式中，步骤(1)中，氯苯溶液所用的溶剂为n,n-二甲基甲酰胺，其浓度优选为50g/l；
44.无机盐培养基、微量元素溶液、氯苯溶液的添加体积比为106:103:2。
45.在一些具体的实施方式中，这里从农药厂获得的土壤样品和液体培养基的用量可以根据实际要求进行调节。例如，步骤(2)中，制得第一混合液时，土壤样品与液体培养基的添加量之比可以为(3-6)g：30ml。同样的，从第一混合液中转移至第二混合液的量与第一混合液体积比可以是1:30至1:10，本发明不局限于此。
46.在一些具体的实施方式中，步骤(2)的整个驯化过程中，所用工具可以根据实际情况具体选择，这里筛选所用的瓶子为150ml钳口血清瓶，用铝盖加垫片密封，其中所加液体为20-30ml，当然，本发明不局限于此。
47.在一些具体的实施方式中，步骤(2)中，驯化条件可以根据实际情况具体选择。比如，这里适用的摇床转速可以是180r/min，培养过程在密闭条件下进行，温度为28℃，每次培养的时间为2-3d。
48.在一些具体的实施方式中，步骤(3)中，稀释涂布分离培养过程具体为：取1ml第n次培养液，用磷酸缓冲液逐级稀释为10-1
，10-2
，10-3
，10-4
，10-5
，10-6
，每个浓度梯度吸取100μl液体后转移至含有氯苯的luria-bertani培养基平板中，用涂步棒进行涂布分离，每个梯度3个平行。培养一定时间后，用接种环挑取合适的单菌落在luria-bertani培养基平板上线分离，如此重复2-3次，将获得的单菌接种至含有氯苯的无机盐培养基中验证降解能力，若观察到氯苯浓度降低且细菌能以氯苯为唯一碳源生长，即为氯苯降解菌。
49.再另一方面，本发明还提出了一种氯苯降解菌在降解氯苯中的应用。
50.本发明提供的氯苯降解菌是pandoraea sp.xjj-1，16s rdna序列genbank登录号为mw453046，保藏编号为cctcc no：m 2021057。所述筛选方法包括：从农药厂周边污染土壤样品中，经驯化、分离和纯化后得到。本发明通过从农药厂周围提取污染土壤，并从中筛选
出氯苯降解菌xjj-1。通过上述氯苯降解菌xjj-1对水中的氯苯进行降解，能达到去除污染物的目的，并且中间产物被彻底降解。该操作成本较低，对环境产生的负面影响小，具有很好的开发利用前景。
51.下面结合具体实施例来对上述实施方式进行更详细的说明。
52.实施例1：
53.菌株的获得
54.从某农药厂采取污染土壤装于棕色瓶中运回实验室，将土壤添加于培养基中制得混合物，通过筛选、驯化获得一株高效氯苯降解菌，并且该菌株具有稳定的传代特性。
55.该菌株革兰氏染色呈阴性，菌株形态无荚膜、杆菌。在luria-bertani培养基平板上菌落形态规则，黄色，凸起，不透明的和光滑。
56.对其进行了16s rdna测序，所测得的16s rdna序列如seq id no.1所示，并将16s rdna序列进行blast比对，比对结果显示，菌株xjj-1的16s rdna的核苷酸序列与潘多拉杆菌属(pandoraea sp.)不同菌株的核苷酸序列有大于99％的同源性。
57.该菌株已于2021年1月保藏于中国典型培养物保藏中心，菌株代码：xjj-1，保藏编号为cctcc no：m 2021057。
58.菌株的具体获得过程如下：
59.(1)将基础无机盐培养基、微量元素混合液和苯溶液混合，得到液体培养基；
60.(2)称取一定质量的农药厂污染土壤样品放置于液体培养基中，恒温摇床培养后得到含有菌的第一培养液，移取10％的第一培养液转移至另一份液体培养基中，培养后得到含有菌的第二培养液，如此重复多次，直至得到第五培养液。
61.(3)将所得第五培养液进行涂布稀释划线分离培养，即得到氯苯降解菌。
62.步骤(1)中，所述的基础无机盐培养基中的无机盐成分包含：0.023g/l cacl2，0.2g/l mgso4·
7h2o，2.5g/l(nh4)2so4，1.0g/l kh2po4，4.5g/l na2hpo4·
12h2o。
63.步骤(1)中，所述的微量元素混合液中的溶质成分包括：0.15g/l znso4·
7h2o，0.26g/l mnso4·
h2o，0.03g/l cocl2·
6h2o，4.5g/l feso4·
7h2o，0.02g/l nicl2·
6h2o，0.01g/l cucl2，0.1g/l na2moo4·
2h2o，0.06g/l h3bo3。
64.步骤(1)中，所述的氯苯溶液(50g/l)所用的溶剂为n,n-二甲基甲酰胺。
65.步骤(1)中所述的无机盐培养基，微量元素溶液，氯苯溶液添加体积比为106:103:2。
66.步骤(2)中，制得第一混合液时，土壤样品与液体培养基的添加量之比为(3-6)g：30ml。
67.步骤(2)的整个驯化过程中，所用工具为150ml钳口血清瓶，用铝盖加垫片密封，其中所加液体一般为20-30ml。
68.步骤(2)中，驯化条件可以是180rpm，培养过程在密闭条件下进行，温度为28℃，每次培养的时间为2-3d左右。
69.步骤(3)中，稀释涂布分离培养过程具体为：取1ml第n次培养液，用磷酸缓冲液逐级稀释为10-1
，10-2
，10-3
，10-4
，10-5
，10-6
，每个浓度梯度吸取100μl液体后转移至含有氯苯的luria-bertani培养基平板中，用涂步棒进行涂布分离，每个梯度3个平行。培养一定时间后，用接种环挑取合适的单菌落在luria-bertani培养基平板上线分离，如此重复2-3次，将
获得的单菌接种至含有氯苯的无机盐培养基中验证降解能力，若观察到氯苯浓度降低且细菌能以氯苯为唯一碳源生长，即为氯苯降解菌。菌落形态如图2所示，形态规则，黄色，微凸起，不透明的和光滑。xjj-1菌的主要形态如图3所示，xjj-1菌呈棒状、无鞭毛。图4展示了xjj-1与潘多拉杆菌属其它菌的亲缘关系，xjj-1与i3-10在发育树的同一支，表明其有较近的亲缘关系。
70.实施例2：
71.菌株降解特性的研究
72.将20ml含有氯苯的无机盐培养基置于150ml血清瓶中，xjj-1于luria-bertani培养基扩大培养后，8000rpm离心5min，并用1％无机盐培养基重悬，洗去酵母粉等碳源，重复2次后总体积不变，在600nm波长条件下测定吸光值，保证降解体系中初始吸光值为0.05。为防止氯苯挥发加盖密封，于28℃，180rpm，避光条件下振荡培养，分别改变氯苯浓度、ph值、酵母粉浓度、温度，12h时后取样，测定氯苯的残留浓度。
73.降解特性结果如图4所示，xjj-1能够耐受600mg/l的氯苯，并在12h内完降解100mg/l氯苯，xjj-1在ph 6-9范围内都能很好的生长并且降解100mg/l的氯苯，少量酵母粉的添加能够促进氯苯的降解，并且在15℃低温条件下亦能高效降解氯苯。
74.实施例3：
75.菌株降解苯系物的底物广谱性研究
76.在150ml血清瓶中加入20ml无机盐培养基，加入培养至对数生长期的细胞菌悬液，使得初始吸光度为0.05。在培养基中分别加入50mg/l苯、甲苯、乙苯，为防止苯系物挥发加盖密封，于28℃，180rpm，避光条件下振荡培养，12h时后取样，测定苯系物的残留浓度。
77.菌株xjj-1对苯系物的降解效果如表1所示，该菌能以苯、甲苯和乙苯为唯一碳源，在12h内可以分别去除100％、77％和83％的苯、甲苯和乙苯。
78.表1 pandoraea sp.xjj-1对不同底物的降解效果
[0079][0080][0081]
实施例4：
[0082]
菌株对地下水体中高浓度氯苯的降解及其中间产物变化的研究
[0083]
取xjj-1菌株在以含氯苯100mg/l的luria-bertani培养基中生长过夜。通过将洗涤过的细胞重悬于不含碳源的无机盐培养基中，并将菌悬液添加至20ml某农药厂氯苯污染地下水中，补加氯苯至100mg/l，初始在600nm波长条件下吸光值为0.05。视情况间隔取样分别测定氯苯残留浓度与产物分布情况，离心除去细胞，并用等体积的乙酸乙酯萃取上清液三次。合并的萃取物用无水硫酸钠干燥，并通过氮气流蒸发至干。然后将浓缩的样品重新溶解在乙腈中，通过孔径为0.22μm的耐溶剂过滤器过滤。并使用带有eclipse xdb-c18(5μm，4.6
×
250mm)的岛津hplc-20a进行分析。流动相由ch3oh/0.1％乙酸组成，流速为1ml/min。
[0084]
图6显示，在前11h内氯苯被快速降解，同时中间产物快速生成(如图7所示)，中间
产物在第9h有最大的累积量，到第11h，氯苯已经被降解完全，且中间产物的量亦在减少，说明xjj-1能彻底降解氯苯，无二次污染物的生成。图1显示了不同时间下培养基中变浑浊的现象，这主要是因为微生物利用氯苯生长和繁殖造成的。为了更好的说明本发明xjj-1的优势，对比了几种降解菌的降解特性，由表1可知，xjj-1降解速率较快，为9.09mg/(l
·
h)，具有一定的优势。
[0085]
表2几种氯苯降解菌降解特性对比
[0086][0087]
实施例5：
[0088]
菌株代谢途径的研究
[0089]
将以氯苯为唯一碳源的降解体系的5个血清瓶中的培养基合并，等体积乙酸乙酯萃取三次后，氮气流蒸干，然后将浓缩的样品重新溶解在乙腈中，经0.22μm的尼龙滤膜过滤器过滤。并使用带有hp-5ms柱的agilent 7890a-5975c气相色谱-质谱仪进行分析，质谱源选择ei源。取xjj-1菌株在以含氯苯100mg/l的luria-bertani培养基中生长过夜，收集离心洗涤后，经超声破碎仪破碎(破碎4次，每次30s，间隔2min)。得到的细胞破碎物在4℃，8000rpm高速离心30min，收集上清液即为粗酶液。构建酶活反应体系：邻苯二酚、细胞粗酶液和磷酸盐缓冲液，在260nm波长处测定邻苯二酚双加氧酶的活性。
[0090]
推测代谢途径如图8所示。结合gc-ms和酶活分析，推测氯苯代谢途径如下：氯苯在氯苯单加氧酶的作用下，两次单羟基化形成关键中间产物3-氯邻苯二酚，然后在邻苯二酚双加氧酶的作用下邻位开环，生成2-氯黏糠酸，之后在相关酶的作用下，逐渐脱氯还原，形成β-酮己二酸，最后进入生物三羧酸循环。
[0091]
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。