一种全细胞催化制备NMNH的方法与流程

：本发明属于酶基因工程，具体涉及一种全细胞催化制备nmnh的方法。

背景技术

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背景技术：

1、还原态烟酰胺单核苷酸(nmnh)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)的前体之一。出于全球抗衰需求的刚性增长，具有明确抗衰老机理的nad+，被越来越多人关注，人们迫不及待寻求更优质的前体来补救体内缺失过半的nad+。令人兴奋的是，nmnh已在实验室与权威学术圈得到证实：相对于nmn，nmnh是更有效的nad+增强剂。

2、随着我国消费者健康意识和抗衰老需求的增长，人们对于nmn、nmnh的接受度将会越来越高并进一步扩大，我国是世界上老年人口最多的国家，60岁以上的老年人口超2.49亿，健康产业却只占gdp的4％～5％，远低于发达国家，抗衰老产品具有庞大的消费市场。

3、目前已有大量关于nmn的制备方法的报道，但是关于nmnh制备方法的报道相对较少，主要是以下几种。

4、第一种就是化学法合成，部分报道公开nmn可以在二氧化硫脲或连二亚硫酸钠等的作用下生成nmnh，但是收率比较低。

5、第二种就是酶法合成，university of amsterdam在2021年报道利用nudc酶可以将nadh分解为nmnh，但同时会生成副产物amp，产率在70％左右，但是底物nadh的价格相对昂贵，nudc酶的转化率也不高，这些都制约着nmnh的工业化应用。

6、因此，我们亟需寻找一种新的制备nmnh的方法。

技术实现思路

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技术实现要素：

1、本发明的目的在于针对现有技术的不足，利用基因工程手段，提供一种新的全细胞催化制备nmnh的方法。

2、本发明公开的技术方案机理如scheme1所示：

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4、本发明公开了一种全细胞催化制备nmnh的方法，其包括：在含有3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapn)、磷酸甘油酸激酶(pgak)、脂肪醛脱氢酶(faldh)和多聚磷酸激酶(ppk)的全细胞催化作用下，将nmn转化为nmnh。

5、进一步，先将3-磷酸甘油醛脱氢酶和磷酸甘油酸激酶构建到质粒pacycduet载体上的两个多克隆位点区域，通过抗性筛选获得含有上述两个基因的细胞。

6、更进一步，所述3-磷酸甘油醛脱氢酶来源于变异链球菌streptococcus mutans，所述磷酸甘油酸激酶来源于假单胞菌pseudomonas sp。

7、进一步，将脂肪醛脱氢酶和聚磷酸激酶通过基因工程技术连接到质粒cdfduet载体上的两个多克隆位点区域，通过抗性筛选获得含有上述两个基因的细胞。

8、更进一步，所述脂肪醛脱氢酶来源于哈氏弧菌vibrio harveyi，所述聚磷酸激酶来源于酿酒酵母saccharomyces cerevisiae。

9、进一步，将上述两个重组受体细胞培养后，提取重组质粒，将两种质粒等比例混合后，再次共转入感受态细胞，借助氯霉素和链霉素的抗性，筛选到含有上述四个基因的重组质粒细胞。

10、更进一步，所述感受态细胞选自大肠杆菌、酵母、枯草芽孢杆菌细胞，优选大肠杆菌。

11、进一步，将含有四个基因的重组细胞进行培养生长，在诱导剂iptg的作用下表达出含有以上四种蛋白的全细胞。

12、进一步，利用能够表达出含有以上四种蛋白的全细胞作为催化剂，控制反应体系ph在6～10之间，缓冲液选自磷酸盐或tris-hcl。

13、更进一步，所述缓冲液浓度在10-100mm之间。

14、更进一步，在催化反应中，全细胞浓度为10～50g/l。

15、更进一步，底物nmn的浓度为20～200mm。

16、本发明的有益效果在于，本发明针对现有技术的不足，实现了全细胞催化制备nmnh的方法，且在合成路径上实现了3-磷酸甘油醛的再生循环，再次利用细胞内自身的nad还原酶，实现了辅酶nadh的再生。通过本发明构建的全细胞可以直接将nmn转化为nmnh，几乎没有副产物产生，提升了原子经济利用性，同时，此催化反应中条件温和，无污染，且成本低，更适于工业化生产。

技术特征：

1.一种全细胞催化制备nmnh的方法，其特征在于，所述方法为在含有3-磷酸甘油醛脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、脂肪醛脱氢酶和多聚磷酸激酶的全细胞催化作用下，将nmn转化为nmnh。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述全细胞的制备方法主要包括以下步骤：1)将3-磷酸甘油醛脱氢酶和磷酸甘油酸激酶构建到质粒pacycduet载体上的两个多克隆位点区域，通过抗性筛选获得含有这两个基因的细胞；2)将脂肪醛脱氢酶和聚磷酸激酶构建到质粒cdfduet载体上的两个多克隆位点区域，通过抗性筛选获得含有这两个基因的细胞；3)将前两步得到的两个重组受体细胞培养后，提取重组质粒，将两种质粒等比例混合后，共转入感受态细胞，筛选到含有上述四个基因的重组质粒细胞。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述3-磷酸甘油醛脱氢酶来源于变异链球菌streptococcus mutans，所述磷酸甘油酸激酶来源于假单胞菌pseudomonas sp，所述脂肪醛脱氢酶来源于哈氏弧菌vibrio harveyi，所述聚磷酸激酶来源于酿酒酵母saccharomyces cerevisiae。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述感受态细胞选自大肠杆菌、酵母、枯草芽孢杆菌细胞。

5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，借助氯霉素和链霉素的抗性，筛选到含有四个基因的重组细胞。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述全细胞浓度为10～50g/l。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述nmn浓度为20～200mm。

技术总结
本发明公开了一种全细胞催化制备NMNH的方法。该方法是在含有3‑磷酸甘油醛脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、脂肪醛脱氢酶和多聚磷酸激酶的全细胞催化作用下，将NMN转化为NMNH。本发明构建的全细胞可以直接将NMN转化为NMNH，几乎没有副产物产生，提升了原子经济利用性，反应条件温和，无污染，更适于工业化生产。

技术研发人员：张小飞,竺伟
受保护的技术使用者：尚科生物医药（上海）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/4/7