一种针对microRNA反复冻融保护剂及其应用的制作方法

一种针对microrna反复冻融保护剂及其应用
技术领域
1.本发明属于分子技术领域，本发明涉及一种针对microrna反复冻融保护剂及其应用。


背景技术：

2.小分子核糖核酸(microrna)，是真核生物中广泛存在的一种小rna分子，在生物体内起到可调节其他基因的表达。microrna是由dna转录而来，但无法翻译成蛋白质的rna。microrna通过与目标mrna结合，抑制基因的表达从而参与细胞的各项生命活动，是当今医学、生物学领域中重点的研究对象。
3.构成microrna的磷酸基团，四个氧原子均带有电量不等的负电荷，而碳、氢和磷原子带有正电荷，一个磷酸基团表现为一个电子电量的等效负电荷，导致磷酸基团质检负电相互排斥，在没有其它外部因素影响下，microrna分子链表现为延展的特征，难以形成折叠的结构，不利于microrna分子的稳定，因为难以形成折叠结构所以microrna分子链容易出现断裂导致降解。microrna易被rna酶降解，而rna酶广泛存在环境中而且稳定，从15-70℃均具有活性。
4.对生物组织、细胞中的rna样本进行保护，一般加入na
+
等离子降低rna分子的延展性，加入异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸(edta)等抑制样本及其它来源的rna酶以提高rna的稳定性，但pcr扩增过程同样使用了酶，其中的抑制剂会对扩增过程造成影响。因为microrna分子在无外部因素影响下难以形成折叠结构，在多次冻融的情况下，在冰冻的过程中极易受到应力的影响导致分子链断裂产生降解。在以microrna作为原材料的产品在生产、运输及存储的各环节中无法避免会出现多次冻融的情况，这不利于产品的稳定性。
5.目前市面上若干商业化的rna生物样本保护剂，如thermofisher的rnalater，碧云天的rnalater主要针对生物组织、细胞中的rna样本进行保护，保护剂反复冻融次数只能在3～5次，而且售价较高不利于用于生产制造，运输或保存中导致的反复冻融。


技术实现要素：

6.为了克服现有技术的不足，本发明提供一种针对microrna反复冻融保护剂及其应用，能保证样本小分子核糖核酸(microrna)在纯化后仍保有高质量和纯度，在经历过9次以上的反复冻融仍具有高效的生物活性，提高了在生产制造、运输及保存中microrna的生物活性。
7.本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
8.本发明提供一种针对microrna反复冻融保护剂，包括0.2m海藻糖、0.1m麦芽糖、5g/l牛血清蛋白、0.22m氯化钠及0.2％吐温20，其余为含50mm tris-edta的depc水。
9.本发明还提供一种采用上述保护剂在试剂盒中的应用。具体在microrna相关试剂盒中应用。
10.本发明提供一种多次反复冻融后仍能保证microrna高效稳定生物活性，并且不影
响后续各种酶活性反应的保护剂。对比市面上相近的产品是一种低价格有利于生产、运输及储存的保护剂。
11.通过改变溶液中离子浓度，降低小分子核糖核酸(microrna)中磷酸基团间的电荷排斥作用，使microrna分子链形成折叠的高级结构，降低microrna分子直接暴露的面积从而使microrna分子更加稳定。
12.改变溶液中离子浓度加强了microrna分子折叠结构，提高了microrna分子的提取效率。
13.通过tris-edta缓冲体系保持溶液在冰冻过程中ph值稳定。
14.通过tris-edta及盐溶液对外源性的rna酶产生抑制降低其活性，降低其对microrna分子的影响。
15.通过多糖、盐溶液及蛋白提高溶液整体的冰点，使提高冰晶形成的温度及速度。降低因冻结过程产生的应力对microrna分子造成损伤。
16.本发明与现有技术相比的有益效果是：
17.本发明提供的保护剂相比现有技术具有以下优点：
18.1.提高了microrna分子抗反复冻融的能力。本发明提供保护剂可以增强microrna抵抗因多次冻融导致的降解，有效保护microrna分子的生物活性。
19.2.有利于生产制造中保护microrna分子的稳定性，反复冻融的稳定性加强，使生产工艺条件变宽。
20.3.对比市面上近似的产品本发明特性更加针对于生产制造，并且成本更低。本发明保护剂成本为市面上类似产品售价的10％。
21.4.本发明提供的保护剂有利于microrna产品的运输及保持，在冷链运输及保存过程中会存在异常状况导致产品出现多次冻融情况，通过保护剂可以降低异常情况对产品的影响。
22.5.本发明提供的保护剂提高了从样本中提取microrna的效率。
23.6.本发明提供的保护剂对长度由17-106nt的microrna分子由良好的保护作用。
具体实施方式
24.下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。
25.实施例1
26.成份表1(1l)
27.成分加入量海藻糖68.4g麦芽糖36g牛血清蛋白5g氯化钠12.8g吐温202mldepc水定容至1lmicrorna样本50μm
28.1.使用电子天平及移液器按上成分表1进行取样配制带有microrna样本的保护液。
29.成份表2(1l)
30.成分加入量depc水1lmicrorna50μm
31.2.使用电子天平及移液器按上成分表2进行取样配制不带保护液样本。
32.3.使用康德(深圳)生物技术有限公司的4种微小核糖核酸(microrna)检测试剂盒(pcr荧光探针法)中a盒对成分表1及成分表2的样本进行处理，静止5min后加入氯仿。
33.4.使用冷冻离心机将参数设置为12,000
×
g、4℃离心15分钟。
34.5.吸取上清加入异丙醇12,000
×
g、4℃离心10分钟。
35.6.弃上清室温自然晾干，干燥后，加入20μl的rnase-free h2o。
36.7.使用康德(深圳)生物技术有限公司的4种微小核糖核酸(microrna)检测试剂盒(pcr荧光探针法)中b盒对上述样本进行转录及扩增。
37.反复冻融效果实验研究
38.1.选取人工合成五个不同碱基数的microrna作为样品：
①
号：17nt、
②
号：43nt、
③
号：62nt、
④
号：83nt、
⑤
号：106nt。
39.2.第一组将五个样品以50mm浓度成分表1中分别配制待用。
40.3.第二组将五个样品以固定50mm浓度按成分表2中分别配制待用。
41.4.使用康德(深圳)生物技术有限公司的4种微小核糖核酸(microrna)检测试剂盒(pcr荧光探针法)a盒对两组样本分别进行提取。
42.5.提取所得的的microrna使用康德(深圳)生物技术有限公司的4种微小核糖核酸(microrna)检测试剂盒(pcr荧光探针法)b盒转录成cdna。反转录条件为42℃反应15分钟，后升温至85℃反应5秒，降温到终止温度4℃。
43.6.转录所得cdna使用康德(深圳)生物技术有限公司的4种微小核糖核酸(microrna)检测试剂盒(pcr荧光探针法)b盒进行扩增检测。预变性反应条件为升温至95℃反应30秒，扩增条件为95℃反应5秒，降温至60℃反应30秒重复45个循环。
44.7.在roche lightcycler 480ⅱ荧光定量pcr仪软件中对数据对扩增数据进行处理得出ct值。
45.8.对上述两组样品进行反复冻融，冰冻条件为-20℃
±
5℃中冰冻8小时以上，溶解条件为室温23℃
±
3℃至完全解冻。
46.9.反复冻融后得出表1数据(ct值)。
47.表1：反复冻融结果表(ct值)
[0048][0049][0050]
由表1数据可得，在实施例1的保护剂下microrna反复9次反复冻融后仍保持良好的生物活性，在对比有保护剂及depc水(无保护剂)的两组数据；在相同浓度的microrna有保护剂的一组明显有效减少提取过程造成的损失，提高提取效率。在depc水的条件下经历6次冻融实验数据已经出现空白数据(无效数据)microrna基本已失去生物活性。。通过表1数据microrna在保护剂中比在depc水(无保护剂)的ct值更向前，证明经提取后对后续反应所涉及的酶不造成影响。本发明的保护剂不需要进行冻干可有效降低反复冻融导致microrna的降解，及有效提高血清中microrna的提取效率。
[0051]
以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的全部实施例。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。