一种高灵敏度的重组酿酒酵母菌株及其构建方法和应用

本发明涉及生物工程，具体涉及一种高灵敏度的重组酿酒酵母菌株及其构建方法和应用。

背景技术：

1、在高等真核生物中，g蛋白偶联受体(gpcr)作为重要的感知受体在胞外信号感知以及细胞间通讯中发挥关键作用。基于gpcr的生物传感器得到广泛发展，其可稳健感知的范围不断扩展。其中在结合gpcr系统后的微生物细胞生物传感器具有明显的鲁棒性，例如酿酒酵母，利用酵母异源表达不同的gpcr后即可实现感知不同的化合物，其具有明显的低成本、多样性和便携优势。基于gpcr的酿酒酵母生物传感器构建具有一个基本的框架，即异源表达gpcr，利用gpcr信号传导通路的下游激活元件结合报告基因以实现信号的输出。为了提高生物传感器中关键的灵敏度、检测时效以及实用性，仍然需要进一步开发与改造。

2、酿酒酵母中，半乳糖诱导系统依旧是被广泛应用的表达系统，半乳糖诱导系统是酵母中严格调节的表达系统，并且在添加半乳糖时，半乳糖相关启动子下的基因可以被诱导>1000倍。对于酿酒酵母gpcr信号传导通路，gpcr系统主要包括信息素和糖感知，信息素途径属于酿酒酵母的交配体系，交配中会发生细胞膜，细胞核以及细胞生长等不同性状的变化，其交配过程涉及多达一百多种基因的表达，其中主要转录因子为ste12。使用ste12转录激活的信息素启动子驱动报告基因的表达，即实现gpcr生物传感器的信号输出。

3、真菌物种中，交配发生取决于两个细胞是否为不同的交配型。以酿酒酵母为例，交配型细胞mata和matα分别分泌a和α信息素，a信息素被matα细胞表面的gpcr-ste3识别，而α信息素被mata细胞表面的gpcr-ste2感知，继而发生细胞融合交配。其他真菌物种同样会产生相应的交配信息素。相关技术中的生物传感器的检测方向较为单一。

技术实现思路

1、本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供一种高灵敏度的重组酿酒酵母菌株及其构建方法和应用。制得的生物传感器可应用不同检测方向，具有低渗漏、较高的信噪比以及较短的检测时效等特点，具有良好的生物监测应用前景。

2、为此，在本发明的一方面，本发明提出了一种高灵敏度的重组酿酒酵母菌株的构建方法，其包括：

3、敲除酿酒酵母中丝氨酸/苏氨酸细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂far1、半乳糖诱导系统的负调节因子gal80和转录激活因子gal4，并将信息素系统转录激活因子ste12的dna结合序列替换为半乳糖诱导系统转录激活因子gal4的dna结合序列，将g蛋白α亚基的启动子替换为持续性启动子tef2，获得第一重组酿酒酵母菌株；

4、将所述第一重组酿酒酵母菌株的半乳糖激酶gal1替换为转录激活因子gal4，得到第二重组酿酒酵母菌株。

5、根据本发明实施例的一种高灵敏度的重组酿酒酵母菌株的构建方法，该方法将酿酒酵母菌株中丝氨酸/苏氨酸细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂far1、半乳糖诱导系统的负调节因子gal80和转录激活因子gal4，并将信息素系统转录激活因子ste12的dna结合序列替换为半乳糖诱导系统转录激活因子gal4的dna结合序列，同时将g蛋白α亚基的启动子替换为持续性启动子tef2；上述基因编辑后的菌株进一步敲除半乳糖激酶gal1并替换为转录激活因子gal4。

6、上述基因编辑后的酵母菌株应用在生物传感器中，例如异源表达真菌信息素，例如白色念珠菌信息素受体ste2能够特异性地识别白色念珠菌α因子信息素，并在感知低浓度信息素后产生强烈的绿色荧光蛋白信号，说明该生物传感器检测具有低渗漏、较高的信噪比等特点，可作为检测其他化合物的生物传感器。

7、另外，根据本发明上述实施例提出的高灵敏度的重组酿酒酵母菌株的构建方法，还可以具有如下附加的技术特征：

8、可选地，包括：

9、(1)pcr扩增获取基因编辑技术的grna表达片段：gfar1cds、ggal80cds、ggal4cds、gste12dbd、ggal1cds和gste2cds，将grna表达片段分别与表达载体p426-snr52-gga连接，得到重组质粒p426-gfar1cds、重组质粒p426-ggal80cds、重组质粒p426-ggal4cds、重组质粒p426-gste12dbd、重组质粒p426-ggpa1pr、重组质粒p426-gsst2cds、重组质粒p426-ggal1cds和重组质粒p426-gste2cds；

10、(2)将所述重组质粒p426-gfar1cds、所述重组质粒p426-ggal80cds、所述重组质粒p426-ggal4cds、所述重组质粒p426-gste12dbd、所述重组质粒p426-ggpa1pr与其对应的基因编辑整合片段电转化入酿酒酵母感受态细胞，得到第一重组菌株；

11、(3)向所述第一重组菌株中导入重组质粒p425gal1-egfp和真菌信息素受体的重组质粒，以便获得第一重组酿酒酵母菌。

12、进一步地，在步骤(2)中，将所述重组质粒p426-gfar1cds、所述重组质粒p426-ggal80cds、所述重组质粒p426-ggal4cds、所述重组质粒p426-gste12dbd、所述重组质粒p426-ggal1cds与其对应的基因编辑整合片段电转化入酿酒酵母感受态细胞，得到第二重组菌株；在步骤(3)向所述第二重组菌株中导入重组质粒p425gal1-egfp和真菌信息素受体的重组质粒，以便获得第二重组酿酒酵母菌。

13、可选地，所述真菌信息素受体为白色念珠菌α因子信息素受体caste2。

14、可选地，所述重组质粒p425gal1-egfp是以载体pk127为模板，以核苷酸序列如seqid no:31所示的egfp_f和核苷酸序列如seq id no:32所示的egfp_r为上下游引物，经pcr扩增得到egfp基因，将egfp基因片段用bamhi和xhoi酶切，随后连接进入经过bamhi和xhoi双酶切的表达载体p425gal1-egfp。

15、进一步地，将所述重组质粒p426-gfar1cds和基因编辑整合片段δfar1电转化入酿酒酵母感受态细胞，通过pcr鉴定获得阳性单克隆，阳性单克隆经5-氟乳清酸筛选去除grna表达载体，得到重组菌株cen.pk2-1cδfar1；将所述重组质粒p426-ggal80cds和基因编辑整合片段δgal80电转化入cen.pk2-1cδfar1感受态细胞，通过pcr鉴定获得阳性单克隆，阳性单克隆经5-氟乳清酸筛选去除grna表达载体，得到重组菌株js-ste-1；将所述重组质粒p426-ggal4cds和基因编辑整合片段δgal4电转化入js-ste-1感受态细胞，通过pcr鉴定获得阳性单克隆，阳性单克隆经5-氟乳清酸筛选去除grna表达载体，得到重组菌株js-ste-1δgal4；将所述重组质粒p426-gste12dbd和基因编辑整合片段δste12dbd:gal4dbd电转化入js-ste-1δgal4感受态细胞，通过pcr鉴定获得阳性单克隆，阳性单克隆经5-氟乳清酸筛选去除grna表达载体，得到重组菌株js-stf-1；将所述重组质粒p426-ggpa1pr和基因编辑整合片段δgpa1pr:tef2pr电转化入js-ste-1δgal4感受态细胞，通过pcr鉴定获得阳性单克隆，阳性单克隆经5-氟乳清酸筛选去除grna表达载体，经传代培养去除cas9表达载体，得到第一重组菌株js-stf-2。

16、进一步地，将所述重组质粒p426-ggal1cds和基因编辑整合片段δgal1:gal4电转化入js-stf-2感受态细胞，通过pcr鉴定获得阳性单克隆，阳性单克隆经5-氟乳清酸筛选去除grna表达载体，经传代培养去除cas9表达载体，得到第二重组菌株js-stf-3。

17、进一步地，还包括重组质粒p426-gste2cds，所述重组质粒p426-gste2cds是以p426-snr52-grna载体为模板，以核苷酸序列如seq id no:2所示的r_sup4和核苷酸序列如seq id no:12所示的f_sp.gste2cds为引物，经pcr扩增得到gste2cds条带，将目的条带经过dna纯化试剂盒回收，得到胶回收产物；将胶回收产物与表达载体p426-snr52-gga连接。

18、进一步地，将重组质粒p426-gste2cds和基因编辑整合片段δste2电转化转入已转入cas9的重组菌株js-stf-2/3感受态细胞，通过pcr鉴定获得阳性单克隆，阳性单克隆经5-氟乳清酸筛选去除grna表达载体，经传代培养去除cas9表达载体，得到重组菌株js-stf-2c/3c。

19、进一步地，将重组质粒p416tef2-caste2、p425gal1-egfp电转化转入重组菌株js-stf-2c/3c感受态细胞，获取第一重组酿酒酵母菌株jsd-stf-2c和第二酿酒酵母菌株jsd-stf-3c。

20、在本发明的第二个方面，本发明提出由上述的构建方法构建得到的高灵敏度的重组酿酒酵母菌株。

21、在本发明的第三个方面，本发明提出包括上述高灵敏度的重组酿酒酵母菌株的基于gpcr的酿酒酵母生物传感器。

22、根据本发明实施例的生物传感器，可感知不同外界信息并以绿色荧光蛋白作为输出信号，具有低渗漏、较高的信噪比等特点，具有良好的生物监测应用前景。

23、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。