surface vitrification, msv)技术和相应的冻存和复苏液配方，通过一系列综合手段加快降温和升温速度，减少家猪精子的冷冻和融化时间，使家猪精子的膜脂质快速玻璃化，减少膜相分离和冰晶损伤；并利用依布硒来稳定膜结构并对抗脂质过氧化，提高精液抗冻性能，使冻融后的精子保持一定活力，便于在生产中使用。
10.具体实施方式
11.下面结合具体实施例对本发明的技术实施方案做进一步详细说明。
12.（一） 玻璃化冷冻液的配置方法为：取1000ml常温去离子水，依次加入54.0克牛血清白蛋白（bsa）、43.1克蔗糖、18.9克海藻糖、5. 94克氯化钠、4.00克乳酸钠60%水溶液、2.10克碳酸氢钠、0.50克葡萄糖、0.35克氯化钾、0.30克二水氯化钙、0.08克青霉素g钠盐、0.05克硫酸链霉素、0.05克磷酸氢二钾、0.05克七水硫酸镁、0.037克丙酮酸钠、0.002克酚红、0.002克依布硒，磁力搅拌充分溶解后备用。
13.（二）玻璃化冷冻解冻液的配置方法为：取1000ml常温去离子水，依次加入14.0克牛血清白蛋白（bsa）、5.94克氯化钠、4.00克乳酸钠60%水溶液、2.10克碳酸氢钠、0.50克葡萄糖、0.35克氯化钾、0.30克二水氯化钙、0.08克青霉素g钠盐、0.05克硫酸链霉素、0.05克磷酸氢二钾、0.05克七水硫酸镁、0.037克丙酮酸钠、0.002克酚红、0.002克依布硒，磁力搅拌充分溶解后备用。
14.（三）玻璃化冷冻金属块：制作长宽高分别为10厘米、4厘米、4厘米的紫铜块；在其10厘米与4厘米边长构成的一个表面制作具有0.5厘米直径开口和0.5厘米深度的小孔1-16个用于快速玻璃化冷冻精子悬液；在其10厘米与4厘米边长构成的另一个表面制作具有1.2厘米直径开口和1.8厘米深度的小孔1-5个用于快速融化已经冷冻的精子悬液（如图2所示）。
15.（四）玻璃化冷冻步骤。
16.1. 采集新鲜家猪精液50毫升，在3小时内完成冻存。
17.2. 将新鲜家猪精液800倍地球重力加速度的离心机中离心10分钟，放置于37摄氏度水浴锅中孵育10分钟，以沉淀死去精子和部分杂质，使活力较好精子游动到上层清液中。
18.3. 将37℃预热好的玻璃化冷冻液与孵育处理后的家猪精液按照1：1体积比稀释处理混匀，制成精子悬液，置于17摄氏度孵育10分钟。
19.4. 将玻璃化冷冻金属块置入液氮中，使金属全高的1厘米左右露出液氮，待金属冷却至液氮温度备用（装置如图3所示），注意不要时间太长，防止金属上凝结太多空气中的水分，影响导热。
20.5. 将预冷后的精子悬液以30微升左右的小滴，滴入在液氮中预冷好的玻璃化冷冻金属块的每个孔中，每孔一滴。
21.6. 待孔中精子悬液完全玻璃化，与液氮温度相同后取出悬液球，密封投入液氮中长期冻存。
22.（五）精子悬液融化步骤：在玻璃化冷冻金属块的2.0毫升规格孔中分别添加1.5毫升玻璃化冷冻解冻液，放置于37摄氏度水浴锅中预热30分钟。将冷冻精子悬液球用镊子快速取出并贴到金属块孔壁上，融化后流入2.0毫升规格孔并迅速融入预热好的玻璃化冷冻解冻液中，完成融化备用。
23.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟
悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的方案的简单变化或等效替换，也应视为本发明的保护范围。
24.下面列举一些本方案的技术优势。
25.1. 本发明建立和优化的金属表面玻璃化冻融技术，能够实现猪精子的高速冷冻和融化，具有操作简单，稳定高效、成本低廉等优点，适应大面积的技术应用性推广。
26.2. 本发明根植于发明人多年来建立的毒理学研究平台，基于猪精子铁死亡等分子机理，针对性地筛选出依布硒这一高效低毒的小分子化合物，能够稳定膜结构防止相分离、并且对抗脂质过氧化，从源头上解决地方猪种精液冷冻的关键技术难题，因此独创性强。
27.附图说明
28.图1依布硒（ebselen）的分子结构图示。
29.图2玻璃化冷冻金属块的实物及开孔图示。
30.图3 玻璃化冷冻金属块置入液氮的相对位置图示。
31.图4 利用金属表面玻璃化冷冻制备的精子悬液球。
技术特征：
1.本发明建立和优化了家猪精子的金属表面玻璃化冻融(metal surface vitrification, msv)方法；包括家猪精子悬液在金属表面快速玻璃化冷冻和解冻步骤及用到的处理液配方；其特征在于将家猪精子悬液滴在液氮预冷的高导热金属块表面，使悬液快速玻璃化冷冻，在使用前将液氮储存的玻璃化悬液在37摄氏度预热的金属块表面孔口快速解冻为液体，流入解冻液。2.权利要求1所述高导热金属块，其金属材质的最优选择为纯铜，但导热率大于200瓦特/米/开尔文的其它金属也能满足要求，其体积应大于实验用到2毫升规格孔总体积的10倍以上；使用时放置于液氮中，上表面应露出液氮液面。3.权利要求1所述金属表面玻璃化冷冻，其具体步骤为使用37℃预热好的玻璃化冷冻液与孵育处理后的家猪精液按照1：1体积比稀释处理混匀，制成精子悬液，然后17摄氏度孵育10分钟，在液氮预冷的高导热金属表面使猪精子的膜脂质快速玻璃化，之后长期保存于液氮中；使用前在玻璃化冷冻金属块的2毫升规格孔中添加1.5毫升玻璃化冷冻解冻液，放置于37摄氏度水浴锅中预热30分钟，将冷冻精子悬液球用镊子快速取出并贴到玻璃化冷冻金属块孔壁上，快速融化流入2毫升规格孔并迅速融入预热好的玻璃化冷冻解冻液中。4.权利要求1所述玻璃化冷冻液的配置方法为：取1000ml常温去离子水，依次加入54.0克牛血清白蛋白（bsa）、43.1克蔗糖、18.9克海藻糖、5. 94克氯化钠、4.00克乳酸钠60%水溶液、2.10克碳酸氢钠、0.50克葡萄糖、0.35克氯化钾、0.30克二水氯化钙、0.08克青霉素g钠盐、0.05克硫酸链霉素、0.05克磷酸氢二钾、0.05克七水硫酸镁、0.037克丙酮酸钠、0.002克酚红、0.002克依布硒，磁力搅拌充分溶解后备用。5.权利要求1所述玻璃化冷冻解冻液的配置方法为：取1000ml常温去离子水，依次加入14.0克牛血清白蛋白（bsa）、5.94克氯化钠、4.00克乳酸钠60%水溶液、2.10克碳酸氢钠、0.50克葡萄糖、0.35克氯化钾、0.30克二水氯化钙、0.08克青霉素g钠盐、0.05克硫酸链霉素、0.05克磷酸氢二钾、0.05克七水硫酸镁、0.037克丙酮酸钠、0.002克酚红、0.002克依布硒，磁力搅拌充分溶解后备用。
技术总结
冷冻保存的家猪精液具有安全、灵活和能长期静态保种等优势，但传统方法制备的家猪冻精，复苏后的质量远低于牛、羊等其他大型牲畜，妨碍了猪精液冷冻保存技术的广泛应用。本发明建立和优化了金属表面玻璃化冻融方法，通过加快降温和升温速度、并在冷冻和融化配方中添加依布硒，减少精子悬液的冷冻和融化时间使之快速玻璃化，进而减少了精子膜结构的相分离和氧化变性，提高了精液抗冻性能，使冻融后的家猪精子受精性能得到极大的提高，能够满足家猪人工授精使用，具有在产业中推广应用的价值。具有在产业中推广应用的价值。
技术研发人员：陈昱光 贺鑫
受保护的技术使用者：西北农林科技大学
技术研发日：2022.09.27
技术公布日：2022/11/22