氯化钠在提高枯草芽孢杆菌合成杆菌霉素D的应用和氯化钠发酵培养基及方法

氯化钠在提高枯草芽孢杆菌合成杆菌霉素d的应用和氯化钠发酵培养基及方法
技术领域
1.本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及氯化钠在提高枯草芽孢杆菌合成杆菌霉素d的应用和氯化钠发酵培养基及方法。


背景技术：

2.杆菌霉素d是由枯草芽孢杆菌中非核糖体肽合酶催化合成的一种属于iturin家族的抗菌脂肽，杆菌霉素d可以抑制黄曲霉和赭曲霉等农业病原真菌，因此，杆菌霉素d在保障粮食和食品安全以及防治真菌污染等方面非常重要。但是，现有技术中利用枯草芽孢杆菌在常规培养基进行发酵培养时杆菌霉素d的产量低。因此急需加强提高杆菌霉素d产量的研究。


技术实现要素：

3.有鉴于此，本发明的目的是提供一种能够有效提高枯草芽孢杆菌合成杆菌霉素d的方式。本发明提供了氯化钠在提高枯草芽孢杆菌合成杆菌霉素d的应用，在基础培养基中添加氯化钠后对枯草芽孢杆菌进行发酵培养生产杆菌霉素d，能够提高杆菌霉素d的产量。
4.为了解决上述技术问题，本发明提出了以下技术方案：
5.本发明提供了氯化钠在提高枯草芽孢杆菌合成杆菌霉素d的应用。
6.本发明提供了一种氯化钠发酵培养基，所述氯化钠发酵培养基以水为溶剂，包含以下浓度的组分：酵母膏0.5～1.0g/l、l-谷氨酸2.0～5.0g/l、葡萄糖5.0～20.0g/l和氯化钠1.0～6.0g/l。
7.优选的，所述氯化钠发酵培养基以水为溶剂，包含以下浓度的组分：酵母膏1.0g/l、l-谷氨酸5.0g/l、葡萄糖20.0g/l和氯化钠3.0g/l。
8.本发明提供了一种提高杆菌霉素d产量的方法，其特征在于，包括以下步骤：采用上述技术方案所述氯化钠发酵培养基对枯草芽孢杆菌种子液进行发酵培养获得杆菌霉素d；所述发酵培养过程分批补料氯化钠发酵培养基。
9.优选的，所述发酵培养为一次补料分批发酵培养；
10.所述一次补料分批发酵培养的条件包括：所述枯草芽孢杆菌种子液接种于氯化钠发酵培养基培养48～84h后补加1次新的氯化钠发酵培养基继续进行发酵培养后获得发酵液。
11.优选的，补加的氯化钠发酵培养基的体积为最初的氯化钠发酵培养基体积的30％～50％。
12.优选的，所述发酵培养的温度为30～37℃，转速为150～200r/min；所述发酵培养时间为139～171h。
13.优选的，所述枯草芽孢杆菌的种子液的制备包括：枯草芽孢杆菌接种于种子培养基，于33～37℃培养至种子培养基的od
600
为0.8～1.0获得枯草芽孢杆菌种子液。
14.优选的，所述枯草芽孢杆菌种子液的接种量为氯化钠发酵培养基体积的3％～5％。
15.优选的，所述杆菌霉素d包括杆菌霉素dc14同系物、杆菌霉素dc15同系物和杆菌霉素dc16同系物中的一种或多种。
16.本发明的有益效果：本发明提供了氯化钠在提高枯草芽孢杆菌合成杆菌霉素d的应用，本发明氯化钠能促进芽孢杆菌的杆菌霉素d合成酶基因表达，以此来提高杆菌霉素d的产量。实施例结果表明：应用本发明提供的氯化钠发酵培养基对枯草芽孢杆菌进行发酵培养获得的杆菌霉素d的产量明显提高，发酵液中杆菌霉素d的含量为478.79
±
13.41mg/l，枯草芽孢杆菌粗肽中的总杆菌霉素d的含量为17.34
±
0.41mg/g。
具体实施方式
17.本发明提供了氯化钠在提高枯草芽孢杆菌合成杆菌霉素d的应用。
18.本发明提供了一种氯化钠发酵培养基，所述氯化钠发酵培养基以水为溶剂，包含以下浓度的组分：酵母膏0.5～1.0g/l、l-谷氨酸2.0～5.0g/l、葡萄糖5.0～20.0g/l和氯化钠1.0～6.0g/l。
19.如无特殊说明，本发明对酵母膏、l-谷氨酸、葡萄糖和氯化钠的来源没有特殊限定，采用常规的市售产品即可。
20.在本发明中，所述氯化钠发酵培养基包括葡萄糖5.0～20.0g/l，优选为13.0～18.0g/l。在本发明实施例中，葡萄糖的添加量优选为20g/l或15.0g/l。
21.在本发明中，所述氯化钠发酵培养基包括酵母膏0.5～1.0g/l，优选为0.6～0.9g/l。在本发明实施例中酵母膏的添加量具体为1.0g/l或0.8g/l。本发明酵母膏可以为枯草芽孢杆菌的生长提供能量物质，促使枯草芽孢杆菌分泌更多的次级代谢产物。
22.在本发明中，所述氯化钠发酵培养基包括l-谷氨酸2.0～5.0g/l，优选为2.5～4.5g/l，更优选为4.0g/l。在本发明实施例中l-谷氨酸的添加量优选为5.0g/l。
23.在本发明中，所述氯化钠发酵培养基包括氯化钠1.0～6.0g/l，优选为2.0～5.0g/l，更优选为3.0g/l。
24.本发明优选所述氯化钠发酵培养基以水为溶剂，包含以下浓度的组分：酵母膏1.0g/l、l-谷氨酸5.0g/l、葡萄糖20.0g/l和氯化钠3.0g/l。
25.本发明所述氯化钠发酵培养基中氯化钠、葡萄糖和l-谷氨酸均能促进杆菌霉素d合成酶基因表达进而有效提高枯草芽孢杆菌合成杆菌霉素d的产量。
26.本发明在酵母膏，l-谷氨酸和葡萄糖组成的基础培养基中添加氯化钠，并通过1次补料分批发酵发酵生产杆菌霉素d，使杆菌霉素d的产量提高，方法简单、易操作，解决了现有技术中枯草芽孢杆菌杆菌霉素d产量低的技术问题。
27.本发明优选对氯化钠发酵培养基进行灭菌，所述灭菌温度优选为115℃、时间优选为20min。
28.本发明提供了一种提高杆菌霉素d产量的方法，包括以下步骤：采用上述技术方案所述氯化钠发酵培养基对枯草芽孢杆菌种子液进行发酵培养获得杆菌霉素d；所述发酵培养过程分批补料氯化钠发酵培养基。
29.在本发明中，所述枯草芽孢杆菌种子液的制备优选包括：枯草芽孢杆菌接种于种
子培养基，于33～37℃培养至种子培养基的od
600
为0.8～1.0获得枯草芽孢杆菌种子液。
30.接种于种子培养基前，本发明优选将斜面保藏的枯草芽孢杆菌接种于种子培养基培养后获得枯草芽孢杆菌种子液。在本发明中，所述种子培养基温度优选为33～37℃，进一步优选为34～36℃，更优选为35℃，在本发明实施例中所述种子培养的温度优选为37℃；本发明优选培养至枯草芽孢杆菌种子液od
600
为0.8～1.0，进一步优选为0.85～0.95，更优选为0.9。本发明实施例中优选培养至枯草芽孢杆菌种子液od
600
为0.8。本发明所述种子培养优选为恒温培养。
31.本发明对所述枯草芽孢杆菌种子液进行发酵培养获得杆菌霉素d；所述发酵培养过程分批补料氯化钠发酵培养基。
32.本发明利用氯化钠发酵培养基对枯草芽孢杆菌种子液进行发酵培养获得杆菌霉素d；所述发酵培养过程分批补料氯化钠发酵培养基。
33.本发明优选将枯草芽孢杆菌种子液接种于氯化钠发酵培养基进行发酵培养。本发明优选按照体积比3％～5％的比例将枯草芽孢杆菌种子液接种于氯化钠发酵培养基，进一步优选为3.5％～4.5％，更优选为4％。在本发明实施例中，枯草芽孢杆菌种子液接种于氯化钠发酵培养基接种量为体积比5％。
34.在本发明中，所述发酵培养的转速优选为150～200r/min，进一步优选为165～195r/min，更优选为180r/min。本发明所述发酵培养的温度为30～37℃，进一步优选为31～34℃，更优选为33℃。在本发明中，所述发酵培养的时间优选为139～171h，进一步优选为143～156h，更优选为147h。在本发明中，所述发酵培养过程分批补料氯化钠发酵培养基；本发明所述发酵培养的时间为总的培养时间，包括补加氯化钠培养基之前的发酵培养总时间和补加氯化钠培养基之后的发酵培养总时间。
35.在本发明中，所述发酵培养优选为一次补料分批发酵培养。本发明所述一次补料分批发酵培养的条件优选包括：所述枯草芽孢杆菌种子液接种于氯化钠发酵培养基培养48～84h后补加1次新的氯化钠发酵培养基继续进行发酵培养后获得发酵液。
36.本发明所述补加氯化钠培养基之前的发酵培养时间优选为48～84h，进一步优选为54～72h，更优选为63h。在本发明实施例中，所述补料分批发酵的条件优选为：将枯草芽孢杆菌种子液接入最初的氯化钠发酵培养基中发酵培养至63h，向发酵液中补加新的氯化钠发酵培养基后发酵培养84h，发酵培养至147h获得枯草芽孢杆菌发酵液。
37.在本发明中，补加的新的氯化钠发酵培养基的体积优选为最初的氯化钠发酵培养基体积的30％～50％，进一步优选为35％～45％，更优选为40％。在本发明实施例中，补加的新的氯化钠发酵培养基的体积优选为最初的氯化钠发酵培养基体积的50％，本发明补加的新的氯化钠发酵培养基的体积为最初的氯化钠发酵培养基体积的50％是为了提高枯草芽孢杆菌发酵生产杆菌霉素d的产量。
38.在本发明中，所述斜面保藏培养基组分优选包括3.0g/l牛肉浸膏，10g/l胰蛋白胨，5g/l氯化钠，15g/l琼脂和水1l。
39.所述种子培养基优选包括3.0g/l牛肉浸膏、10g/l胰蛋白胨、5g/l氯化钠和水1l。所述氯化钠发酵培养基在上文已经论述，在此不再赘述。
40.获得枯草芽孢杆菌发酵液后，本发明优选对枯草芽孢杆菌发酵液依次进行第一次离心、酸沉、第二次离心、萃取和第三次离心获得杆菌霉素d。本发明将枯草芽孢杆菌发酵液
进行第一次离心，获得上清液后，本发明优选对上清液进行酸沉浸提和第二次离心获得杆菌霉素d粗肽。本发明所述酸沉优选利用hcl将上清液的ph值调至2.0以下，室温静置4h获得酸沉后的上清液进行第二次离心。本发明所述第一次离心的转速优选为5500～6500r/min，进一步优选为5900～6100r/min，更优选为6000r/min。本发明所述第二次离心的转速与第一次离心的转速相同。本发明所述第一次离心的时间优选为10～20min，进一步优选为13～18min，更优选为15min，第二次离心时间优选为10min。
41.获得杆菌霉素d粗肽沉淀后，本发明优选对获得的杆菌霉素d粗肽沉淀进行萃取和第三次离心，获得萃取上清液。在本发明中，本发明所述萃取的时间为70～80min，更优选为72min；所述萃取用萃取剂优选为甲醇，所述杆菌霉素d粗肽沉淀与甲醇的用量比优选为0.1～0.5g：0.5～2.0ml，进一步优选为0.3～0.5g：1.5ml，更优选为0.4g：1.5ml。在本发明中，所述第三次离心的转速优选为8000～12000r/min，进一步优选为9500～10500r/min，更优选为10000r/min，离心时间优选为7～11min，进一步优选为9～10.5min，更优选为10min。本发明甲醇可以有效萃取杆菌霉素d。
42.获得萃取上清液后，本发明优选采用高效液相色谱(hplc)法对萃取上清液中的杆菌霉素d及其同系物的含量进行测定。本发明所述杆菌霉素d包括杆菌霉素dc14同系物、杆菌霉素dc15同系物和杆菌霉素dc16同系物中的一种或多种。在本发明中，所述杆菌霉素dc14同系物为十四碳β-氨基脂肪酸环七肽(c
14-β-nh2cooh-asn-tyr-asn-proglu-ser-thr)；所述杆菌霉素dc15同系物为十五碳β-氨基脂肪酸环七肽(c
15-β-nh2cooh-asn-tyr-asn-proglu-ser-thr)；所述杆菌霉素dc16同系物为十六碳β-氨基脂肪酸环七肽(c
16-β-nh2cooh-asn-tyr-asn-proglu-ser-thr)。利用本发明的技术方案枯草芽孢杆菌发酵生产杆菌霉素d的总产量、杆菌霉素dc14同系物产量、杆菌霉素dc15同系物产量和杆菌霉素dc16同系物产量均提高。
43.金属盐可以激活生物合成途径中某些基因和酶来提高目标代谢产物的合成能力。本发明创新性的将氯化钠添加在基础培养基中，制备氯化钠发酵培养基，并采用补料分批发酵生产杆菌霉素d，解决了现有技术中杆菌霉素d的产量低的技术问题，为实现杆菌霉素d大规模的工业化生产奠定技术支撑。
44.为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
45.实施例1
46.1培养基
47.氯化钠发酵培养基组分：酵母膏1.0g/l、l-谷氨酸5.0g/l、葡萄糖20.0g/l、氯化钠3g/l和1l水。
48.斜面保藏培养基组分：牛肉浸膏3.0g/l、胰蛋白胨10g/l、氯化钠5g/l、琼脂15g/l和1l水。
49.种子培养基组分：牛肉浸膏3.0g/l，胰蛋白胨10g/l、氯化钠5g/l和1l水。
50.2补料分批发酵培养
51.(1)挑取斜面保藏的枯草芽孢杆菌接入种子培养基，在温度为37℃的条件下恒温培养至枯草芽孢杆菌种子液od
600
为0.8即可，获得枯草芽孢杆菌种子液。
52.(2)将步骤(1)的枯草芽孢杆菌种子液接种于氯化钠发酵培养基进行补料分批发
酵培养。以接种完成开始计时：氯化钠发酵培养基的体积为300ml，枯草芽孢杆菌种子液的体积为15ml，枯草芽孢杆菌种子液的接种体积为氯化钠发酵培养基体积的5％，接种后在温度为33℃，转速为180r/min的条件下进行发酵培养至63h，向发酵液中添加1次新鲜的氯化钠发酵培养基125ml，于温度为33℃，180r/min的条件下继续发酵培养至147h，获得枯草芽孢杆菌补料分批发酵培养发酵液。补料分批发酵培养总时间为147h。
53.取40.0ml枯草芽孢杆菌发酵液于6000r/min的条件下离心15min，弃菌体，取上清液，用hcl将上清液ph调至2.0以下，室温静置4h，再次在6000r/min的条件下离心10min，得到杆菌霉素d粗肽沉淀，在沉淀0.4g中加入1.5ml甲醇进行萃取，萃取时间为72min，10000r/min离心10min，取上清液，采用高效液相色谱(hplc)法对上清液中的杆菌霉素d及其同系物的含量进行测定。
54.该补料分批发酵培养实验共设置5个平行实验。
55.实施例2
56.发酵培养基中添加氯化钠，氯化钠的添加量为1.0g/l，其余条件同实施例1。
57.实施例3
58.发酵培养基中添加氯化钠，氯化钠的添加量为6.0g/l，其余条件同实施例1。
59.对比例1
60.不进行补料，其余条件同实施例1。
61.对比例2
62.发酵培养基中不添加氯化钠，其余条件同实施例1。
63.对比例3
64.发酵培养基中以碳酸钠替换氯化钠，其余条件同实施例1。
65.对比例4
66.发酵培养基中添加氯化钠，氯化钠的添加量为0.5g/l，其余条件同实施例1。
67.对比例5
68.发酵培养基中添加氯化钠，氯化钠的添加量为8g/l，其余条件同实施例1。
69.对实施例1～3和对比例1～5获得的枯草芽孢杆菌发酵液中的杆菌霉素d及其同系物的含量进行测定，测定方法采用高效液相色谱(hplc)法。具体hplc条件和测定方法参照现有技术(qian shiquan,lu hedong,meng panpan,zhang chong,lv fengxia,bie xiaomei,lu zhaoxin,effect of inulin on efficient production and regulatory biosynthesis ofbacillomycin d in bacillus subtilis fmbj,bioresource technology,2015,179:260-267.)进行。实施例1～3和对比例1～5的5次平行实验的测定结果的平均值见表1。
70.表1实施例1～3和对比例1～5获得的枯草芽孢杆菌发酵液中的杆菌霉素d及其同系物的含量(mg/l)和粗肽中杆菌霉素d含量(mg/g)
[0071][0072]
根据表1可知，本发明以氯化钠发酵培养基为基料进行1次补料发酵，有效提高了枯草芽孢杆菌的杆菌霉素d产量。
[0073]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。