一种神经细胞组合和其应用的制作方法

1.本发明涉及生物领域，具体涉及神经细胞制剂形式技术领域，特别是涉及一种神经相关细胞的制剂方法及其应用。


背景技术：

2.干细胞具有再生和重建能力，基于干细胞技术的再生医学可以补充缺失的神经细胞，有望为解决退行性疾病等许多组织细胞缺损性疾病的治疗提供新的途径。近年来，大量临床前研究结果显示人多能干细胞分化的多巴胺神经细胞对非人灵长类帕金森病模型具有良好的治疗效果。
3.但是，目前神经细胞移植主要是消化后的单细胞，细胞存在神经纤维断裂的情况，以及氧化应激等微环境的问题导致多巴胺神经细胞移植后存活较差，据估计存活的仅有10％，如何提高神经细胞的体内存活是目前首要解决的问题。


技术实现要素：

4.神经相关细胞(如多巴胺神经细胞)经消化后以单细胞悬液的方式进行冻存和移植，其体内存活能力差。本技术发明人发现，提前将神经相关细胞(如多巴胺神经细胞)悬浮成细胞小球可以明显提高神经相关细胞(如多巴胺神经细胞)的(如体内)存活率。
5.所述神经相关细胞来源为体细胞重编程、干细胞分化、原代分离等。优选地，所述干细胞是多能干细胞，如胚胎干细胞。细胞来源包括但不限于各种动物，例如哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、兔科动物、啮齿类动物(例如，小鼠或大鼠)、非人灵长类动物(例如，猕猴或食蟹猴)或人。
6.为此，在本发明的第一方面，本发明提供了神经细胞球，其包含多个神经相关细胞，所述神经相关细胞包含神经前体细胞、神经细胞、神经胶质细胞或其任意组合，所述神经细胞球的直径为30-500μm，例如30-40μm、40-50μm、50-60μm、60-70μm、70-80μm、80-90μm、90-100μm、100-110μm、110-120μm、120-130μm、130-140μm、140-150μm、150-160μm、160-170μm、170-180μm、180-190μm、190-200μm、200-210μm、210-220μm、220-230μm、230-240μm、240-250μm、250-260μm、260-270μm、270-280μm、280-290μm、290-300μm、300-310μm、310-320μm、320-330μm、330-340μm、340-350μm、350-360μm、360-370μm、370-380μm、380-390μm、390-400μm、400-410μm、410-420μm、420-430μm、430-440μm、440-450μm、450-460μm、460-470μm、470-480μm、480-490μm或490-500μm。
7.在一些实施方案中，所述神经细胞球的直径为80-300μm(如80-120μm、120-200μm或180-300μm，或者80-180μm)。
8.在一些实施方案中，所述神经细胞球的直径为80-200μm(如80-120μm或120-200μm，或者80-180μm)。
9.在一些实施方案中，所述神经细胞球表达标志物tuj1。
10.在一些实施方案中，所述神经细胞球中，至少约55％(例如至少约57％、至少约
59％、至少约60％、至少约61％、至少约63％、至少约65％、至少约67％、至少约69％或至少约70％)的神经相关细胞表达标志物tuj1。
11.在一些实施方案中，所述神经细胞球中，至少约70％的神经相关细胞表达标志物tuj1。
12.在一些实施方案中，所述神经细胞球不表达或低表达标志物caspase3。
13.在一些实施方案中，所述神经细胞球中，不超过约40％(如不超过约35％、不超过约30％、不超过约25％、不超过约20％、不超过约15％、不超过约10％或不超过约5％)的神经相关细胞表达标志物caspase3。
14.在一些实施方案中，所述神经细胞球中，不超过约15％(优选不超过约10％或不超过约5％)的神经相关细胞表达标志物caspase3。
15.在一些实施方案中，所述神经相关细胞包含神经前体细胞。在一些实施方案中，所述神经相关细胞还包含神经细胞和/或神经胶质细胞。
16.在一些实施方案中，所述神经相关细胞为神经前体细胞。
17.在一些实施方案中，所述神经前体细胞选自多巴胺神经前体细胞、γ-氨基丁酸(gaba)能神经元前体细胞、谷氨酸能神经元前体细胞、胆碱能神经元前体细胞、五羟色胺能神经元前体细胞、运动神经元前体细胞、感觉神经元前体细胞或其任意组合。
18.在一些实施方案中，所述神经前体细胞为多巴胺神经前体细胞。
19.在一些实施方案中，所述神经细胞选自多巴胺能神经元、γ-氨基丁酸(gaba)能神经元、谷氨酸能神经元、胆碱能神经元、五羟色胺能神经元、运动神经元、感觉神经元或其任意组合。
20.在一些实施方案中，其中，所述神经胶质细胞选自星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞或其任意组合。
21.在一些实施方案中，所述神经相关细胞的来源为体细胞重编程、干细胞分化、原代分离等。优选地，所述干细胞是多能干细胞，如胚胎干细胞。细胞的来源包括但不限于各种动物，例如哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、兔科动物、啮齿类动物(例如，小鼠或大鼠)、非人灵长类动物(例如，猕猴或食蟹猴)或人。
22.在本发明的第二方面，本发明提供了制备前述的神经细胞球的方法，其包括：
23.将神经相关细胞的单细胞悬液接种到低贴附细胞培养板中，形成所述神经细胞球，所述神经相关细胞选自神经前体细胞、神经细胞、神经胶质细胞或其任意组合；
24.其中，所述神经相关细胞的接种密度为5
×
103/cm2～5
×
106/cm2，例如为5
×
103/cm2～1
×
104/cm2、1
×
104/cm2～2.5
×
104/cm2、2.5
×
104/cm2～5
×
104/cm2、5
×
104/cm2～1
×
105/cm2、1
×
105/cm2～2.5
×
105/cm2、2.5
×
105/cm2～5
×
105/cm2、5
×
105/cm2～1
×
106/cm2、1
×
106/cm2～2.5
×
106/cm2或2.5
×
106/cm2～5
×
106/cm2。
25.在一些实施方案中，所述神经相关细胞的接种密度为5
×
104/cm2～5
×
105/cm2(如5
×
104/cm2、2.5
×
105/cm2或5
×
105/cm2)。
26.在一些实施方案中，所述神经相关细胞的接种密度为5
×
104/cm2～2.5
×
105/cm2(如5
×
104/cm2或2.5
×
105/cm2)
27.在一些实施方案中，所述神经相关细胞的接种量为1
×
104/孔～1
×
107/孔，例如为1
×
104/孔～5
×
104/孔、5
×
104/孔～1
×
105/孔、1
×
105/孔～5
×
105/孔、5
×
105/孔～1
×
106/孔、1
×
106/孔～5
×
106/孔或5
×
106/孔～1
×
107/孔，且所述培养板为24孔板。
28.在一些实施方案中，所述神经相关细胞的接种量为1
×
105/孔～1
×
106/孔(如1
×
105/孔、5
×
105/孔或1
×
106/孔)，且所述培养板为24孔板。
29.在一些实施方案中，所述神经相关细胞的接种量为1
×
105/孔～5
×
105/孔(如1
×
105/孔或5
×
105/孔)，且所述培养板为24孔板。
30.在一些实施方案中，其中，所述神经相关细胞包含神经前体细胞。在一些实施方案中，所述神经相关细胞还包含神经细胞和/或神经胶质细胞。
31.在一些实施方案中，所述神经相关细胞为神经前体细胞。
32.在一些实施方案中，所述神经前体细胞选自多巴胺神经前体细胞、γ-氨基丁酸(gaba)能神经元前体细胞、谷氨酸能神经元前体细胞、胆碱能神经元前体细胞、五羟色胺能神经元前体细胞、运动神经元前体细胞、感觉神经元前体细胞或其任意组合。
33.在一些实施方案中，所述神经前体细胞为多巴胺神经前体细胞。
34.在一些实施方案中，所述神经细胞选自多巴胺能神经元、γ-氨基丁酸(gaba)能神经元、谷氨酸能神经元、胆碱能神经元、五羟色胺能神经元、运动神经元、感觉神经元或其任意组合。
35.在一些实施方案中，所述神经胶质细胞选自星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞或其任意组合。
36.在一些实施方案中，所述神经相关细胞的来源为体细胞重编程、干细胞分化、原代分离等。优选地，所述干细胞是多能干细胞，如胚胎干细胞。细胞的来源包括但不限于各种动物，例如哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、兔科动物、啮齿类动物(例如，小鼠或大鼠)、非人灵长类动物(例如，猕猴或食蟹猴)或人。
37.在一些实施方案中，所述培养板为圆底或尖底微孔板。
38.在一些实施方案中，所述培养板为aggrewell
tm
培养板。
39.在一些实施方案中，将神经相关细胞的单细胞悬液接种到低贴附细胞培养板中后，培养10-30小时(如10-12小时、12-14小时、14-18小时、18-20小时、20-22小时、22-24小时、24-26小时、26-28小时或28-30小时，优选24小时)，形成所述神经细胞球。
40.在一些实施方案中，所述接种时使用的培养基为接种培养基，所述接种培养基包含：
41.脑源性神经营养因子(bdnf)，
42.胶质细胞源性神经营养因子(gdnf)，
43.转化生长因子β3(tgf-β3)，
44.抗坏血酸，
45.二丁酰环磷腺苷钙(db-camp)，
46.dapt(ly-374973)。
47.在一些实施方案中，所述接种培养基进一步包含：y27632。
48.在一些实施方案中，所述脑源性神经营养因子(bdnf)的浓度为1-100ng/ml，例如为1-5ng/ml、5-10ng/ml、10-15ng/ml、15-20ng/ml、20-25ng/ml、25-30ng/ml、30-35ng/ml、35-40ng/ml、40-45ng/ml、45-50ng/ml、50-55ng/ml、55-60ng/ml、60-65ng/ml、65-70ng/ml、70-75ng/ml、75-80ng/ml、80-85ng/ml、85-90ng/ml、90-95ng/ml或95-100ng/ml。
49.在一些实施方案中，所述脑源性神经营养因子(bdnf)的浓度为10-20ng/ml。
50.在一些实施方案中，所述脑源性神经营养因子(bdnf)的浓度为20ng/ml。
51.在一些实施方案中，所述胶质细胞源性神经营养因子(gdnf)的浓度为1-100ng/ml，例如为1-5ng/ml、5-10ng/ml、10-15ng/ml、15-20ng/ml、20-25ng/ml、25-30ng/ml、30-35ng/ml、35-40ng/ml、40-45ng/ml、45-50ng/ml、50-55ng/ml、55-60ng/ml、60-65ng/ml、65-70ng/ml、70-75ng/ml、75-80ng/ml、80-85ng/ml、85-90ng/ml、90-95ng/ml或95-100ng/ml。
52.在一些实施方案中，所述胶质细胞源性神经营养因子(gdnf)的浓度为10-20ng/ml。
53.在一些实施方案中，所述胶质细胞源性神经营养因子(gdnf)的浓度为20ng/ml。
54.在一些实施方案中，所述转化生长因子β3(tgf-β3)的浓度为0.5-50ng/ml，例如为0.5-0.7ng/ml、0.7-1ng/ml、1-1.3ng/ml、1.3-1.5ng/ml、1.5-1.7ng/ml、1.7-2ng/ml、2-2.5ng/ml、2.5-3ng/ml、3-3.5ng/ml、3.5-4ng/ml、4-4.5ng/ml、4.5-5ng/ml、5-10ng/ml、10-15ng/ml、15-20ng/ml、20-25ng/ml、25-30ng/ml、30-35ng/ml、35-40ng/ml、40-45ng/ml或45-50ng/ml。
55.在一些实施方案中，所述转化生长因子β3(tgf-β3)的浓度为1-10ng/ml。
56.在一些实施方案中，所述转化生长因子β3(tgf-β3)的浓度为1ng/ml。
57.在一些实施方案中，所述抗坏血酸的浓度为0.01-2mm，例如为0.01-0.03mm、0.03-0.05mm、0.05-0.07mm、0.07-0.1mm、0.1-0.13mm、0.13-0.15mm、0.15-0.17mm、0.17-0.2mm、0.2-0.23mm、0.23-0.25mm、0.25-0.27mm、0.27-0.3mm、0.3-0.4mm、0.4-0.5mm、0.5-0.7mm、0.7-0.9mm、0.9-1.1mm、1.1-1.3mm、1.3-1.5mm、1.5-1.7mm、1.7-1.9mm或1.9-2.0mm。
58.在一些实施方案中，所述抗坏血酸的浓度为0.2mm。
59.在一些实施方案中，所述二丁酰环磷腺苷钙(db-camp)的浓度为0.01-5mm，例如为0.01-0.03mm、0.03-0.05mm、0.05-0.07mm、0.07-0.1mm、0.1-0.2mm、0.2-0.3mm、0.3-0.4mm、0.4-0.5mm、0.5-0.7mm、0.7-0.9mm、0.9-1.1mm、1.1-1.3mm、1.3-1.5mm、1.5-1.7mm、1.7-1.9mm、1.9-2.0mm、2.0-2.1mm、2.1-2.3mm、2.3-2.5mm、2.5-2.7mm、2.7-2.9mm、2.9-3.0mm、3.0-3.1mm、3.1-3.3mm、3.3-3.5mm、3.5-3.7mm、3.7-3.9mm、3.9-4.0mm、4.0-4.1mm、4.1-4.3mm、4.3-4.5mm、4.5-4.7mm、4.7-4.9mm或4.9-5.0mm。
60.在一些实施方案中，所述二丁酰环磷腺苷钙(db-camp)的浓度为0.5mm。
61.在一些实施方案中，所述dapt(ly-374973)的浓度为1-100μm，例如为1-5μm、5-10μm、10-15μm、15-20μm、20-25μm、25-30μm、30-35μm、35-40μm、40-45μm、45-50μm、50-55μm、55-60μm、60-65μm、65-70μm、70-75μm、75-80μm、80-85μm、85-90μm、90-95μm或95-100μm。
62.在一些实施方案中，所述dapt(ly-374973)的浓度为10μm。
63.在一些实施方案中，所述y27632的浓度为1-50μm，例如为1-2μm、2-3μm、3-4μm、4-5μm、5-6μm、6-7μm、7-8μm、8-9μm、9-10μm、10-11μm、11-12μm、12-13μm、13-14μm、14-15μm、15-16μm、16-17μm、17-18μm、18-19μm、19-20μm、20-25μm、25-30μm、30-35μm、35-40μm、40-45μm或45-50μm。
64.在一些实施方案中，所述y27632的浓度为10μm。
65.在一些实施方案中，所述接种培养基进一步包含：基础培养基。
66.在一些实施方案中，所述基础培养基包含：
67.neurobasal，
68.b27-supplement，
69.glutamax。
70.在一些实施方案中，所述基础培养基中，所述neurobasal的体积分数为70％-99％，例如为70％-71％、71％-73％、73％-75％、75％-77％、77％-79％、79％-80％、80％-81％、81％-83％、83％-85％、85％-87％、87％-89％、89％-90％、90％-91％、91％-93％、93％-95％、95％-97％或97％-99％。
71.在一些实施方案中，所述基础培养基中，所述neurobasal的体积分数为97％。
72.在一些实施方案中，所述基础培养基中，所述b27-supplement的体积分数为0.1％-20％，例如为0.1％-0.15％、0.15％-0.2％、0.2％-0.25％、0.25％-0.3％、0.3％-0.35％、0.35％-0.4％、0.4％-0.45％、0.45％-0.5％、0.5％-0.55％、0.55％-0.6％、0.6％-0.65％、0.65％-0.7％、0.7％-0.75％、0.75％-0.8％、0.8％-0.85％、0.85％-0.9％、0.9％-0.95％、0.95％-1.0％、1.0％-1.1％、1.1％-1.3％、1.3％-1.5％、1.5％-1.7％、1.7％-1.9％、1.9％-2.0％、2.0％-2.1％、2.1％-2.3％、2.3％-2.5％、2.5％-2.7％、2.7％-2.9％、2.9％-3.0％、3.0％-3.1％、3.1％-3.3％、3.3％-3.5％、3.5％-3.7％、3.7％-3.9％、3.9％-4.0％、4.0％-4.1％、4.1％-4.3％、4.3％-4.5％、4.5％-4.7％、4.7％-4.9％、4.9％-5.0％、5.0％-5.5％、5.5％-6.0％、6.0％-6.5％、6.5％-7.0％、7.0％-7.5％、7.5％-8.0％、8.0％-8.5％、8.5％-9.0％、9.0％-9.5％、9.5％-10％、10％-10.5％、10.5％-11％、11％-11.5％、11.5％-12％、12％-12.5％、12.5％-13％、13％-13.5％、13.5％-14％、14％-14.5％、14.5％-15％或15％-20％。
73.在一些实施方案中，所述基础培养基中，所述b27-supplement的体积分数2％。
74.在一些实施方案中，所述基础培养基中，所述glutamax的体积分数为0.1％-10％，例如为0.1％-0.15％、0.15％-0.2％、0.2％-0.25％、0.25％-0.3％、0.3％-0.35％、0.35％-0.4％、0.4％-0.45％、0.45％-0.5％、0.5％-0.55％、0.55％-0.6％、0.6％-0.65％、0.65％-0.7％、0.7％-0.75％、0.75％-0.8％、0.8％-0.85％、0.85％-0.9％、0.9％-0.95％、0.95％-1.0％、1.0％-1.1％、1.1％-1.3％、1.3％-1.5％、1.5％-1.7％、1.7％-1.9％、1.9％-2.0％、2.0％-2.1％、2.1％-2.3％、2.3％-2.5％、2.5％-2.7％、2.7％-2.9％、2.9％-3.0％、3.0％-3.1％、3.1％-3.3％、3.3％-3.5％、3.5％-3.7％、3.7％-3.9％、3.9％-4.0％、4.0％-4.1％、4.1％-4.3％、4.3％-4.5％、4.5％-4.7％、4.7％-4.9％、4.9％-5.0％、5.0％-5.5％、5.5％-6.0％、6.0％-6.5％、6.5％-7.0％、7.0％-7.5％、7.5％-8.0％、8.0％-8.5％、8.5％-9.0％、9.0％-9.5％或9.5％-10％。
75.在一些实施方案中，所述基础培养基中，所述glutamax的体积分数为1％。
76.在一些实施方案中，所述基础培养基中各组分的体积分数总和为100％。
77.在一些实施方案中，所述接种培养基中各组分(即bdnf、gdnf、tgf-β3、抗坏血酸、db-camp、dapt和任选的y27632)的浓度指的是前述各组分在所述基础培养基中的浓度。
78.在一些实施方案中，所述神经相关细胞的单细胞悬液是通过如下方法制备得到的：将神经相关细胞进行消化，获得所述神经相关细胞的单细胞悬液。
79.在一些实施方案中，所述消化后，进一步包括：加入前述的接种培养基。
80.在一些实施方案中，所述消化是利用tryple或accutase进行的。
81.在本发明的第三方面，本发明提供了神经细胞球，其由前述的方法制备得到。
82.在一些实施方案中，所述神经细胞球的直径为30-500μm，例如30-40μm、40-50μm、50-60μm、60-70μm、70-80μm、80-90μm、90-100μm、100-110μm、110-120μm、120-130μm、130-140μm、140-150μm、150-160μm、160-170μm、170-180μm、180-190μm、190-200μm、200-210μm、210-220μm、220-230μm、230-240μm、240-250μm、250-260μm、260-270μm、270-280μm、280-290μm、290-300μm、300-310μm、310-320μm、320-330μm、330-340μm、340-350μm、350-360μm、360-370μm、370-380μm、380-390μm、390-400μm、400-410μm、410-420μm、420-430μm、430-440μm、440-450μm、450-460μm、460-470μm、470-480μm、480-490μm或490-500μm。
83.在一些实施方案中，所述神经细胞球的直径为80-300μm(如80-120μm、120-200μm或180-300μm，或者80-180μm)。
84.在一些实施方案中，所述神经细胞球的直径为80-200μm(如80-120μm或120-200μm，或者80-180μm)。
85.在一些实施方案中，所述神经细胞球表达标志物tuj1。
86.在一些实施方案中，所述神经细胞球中，至少约55％(例如至少约57％、至少约59％、至少约60％、至少约61％、至少约63％、至少约65％、至少约67％、至少约69％或至少约70％)的神经相关细胞表达标志物tuj1。
87.在一些实施方案中，所述神经细胞球中，至少约70％的神经相关细胞表达标志物tuj1。
88.在一些实施方案中，所述神经细胞球不表达或低表达标志物caspase3。
89.在一些实施方案中，所述神经细胞球中，不超过约40％(如不超过约35％、不超过约30％、不超过约25％、不超过约20％、不超过约15％、不超过约10％或不超过约5％)的神经相关细胞表达标志物caspase3。
90.在一些实施方案中，所述神经细胞球中，不超过约15％(优选不超过约10％或不超过约5％)的神经相关细胞表达标志物caspase3。
91.在本发明的第四方面，本发明提供了神经细胞球冻存制剂，其包含：神经细胞球，所述神经细胞球如前所述。
92.在一些实施方案中，所述神经细胞球冻存制剂进一步包含：神经细胞球冻存液。
93.在一些实施方案中，所述神经细胞球冻存液中，所述神经细胞球的细胞总密度为105/ml～107/ml，例如为1
×
105/ml～3
×
105/ml、3
×
105/ml～5
×
105/ml、5
×
105/ml～7
×
105/ml、7
×
105/ml～1
×
106/ml、1
×
106/ml～3
×
106/ml、3
×
106/ml～5
×
106/ml、5
×
106/ml～7
×
106/ml或7
×
106/ml～1
×
107/ml。
94.在一些实施方案中，所述神经细胞球冻存液中，所述神经细胞球的细胞总密度为3
×
106/ml。
95.需要说明的是，所述神经细胞球的细胞总密度指的是每毫升的神经细胞球冻存液中细胞的总个数。
96.在一些实施方案中，所述神经细胞球冻存液包含：
97.基础成分，
98.b27 supplement，
99.n2 supplement，
100.glutamax，
101.dmso，
102.y27632，
103.人血清白蛋白(hsa)或胎牛血清，
104.所述基础成分选自neurobasal、kodmem/f12或其组合。
105.在一些实施方案中，所述神经细胞球冻存液进一步包含：非渗透性保护剂。
106.在一些实施方案中，所述非渗透性保护剂选自葡聚糖、海藻酸钠、透明质酸钠、γ-聚谷氨酸或其任意组合。
107.在一些实施方案中，所述基础成分的体积分数为1％-84％，例如为1％-3％、3％-5％、5％-7％、7％-9％、9％-11％、11％-13％、13％-15％、15％-17％、17％-19％、19％-20％、20％-21％、21％-23％、23％-25％、25％-27％、27％-29％、29％-30％、30％-31％、31％-33％、33％-35％、35％-37％、37％-39％、39％-40％、40％-41％、41％-43％、43％-45％、45％-47％、47％-49％、49％-50％、50％-51％、51％-53％、53％-55％、55％-57％、57％-59％、59％-60％、60％-61％、61％-63％、63％-65％、65％-67％、67％-69％、69％-70％、70％-71％、71％-73％、73％-75％、75％-77％、77％-79％、79％-80％、80％-81％、81％-83％或83％-84％。
108.在一些实施方案中，所述基础成分的体积分数为79％。
109.在一些实施方案中，所述neurobasal的体积分数为1％-84％，例如为1％-3％、3％-5％、5％-7％、7％-9％、9％-11％、11％-13％、13％-15％、15％-17％、17％-19％、19％-20％、20％-21％、21％-23％、23％-25％、25％-27％、27％-29％、29％-30％、30％-31％、31％-33％、33％-35％、35％-37％、37％-39％、39％-40％、40％-41％、41％-43％、43％-45％、45％-47％、47％-49％、49％-50％、50％-51％、51％-53％、53％-55％、55％-57％、57％-59％、59％-60％、60％-61％、61％-63％、63％-65％、65％-67％、67％-69％、69％-70％、70％-71％、71％-73％、73％-75％、75％-77％、77％-79％、79％-80％、80％-81％、81％-83％或83％-84％。
110.在一些实施方案中，所述neurobasal的体积分数为39.5％。
111.在一些实施方案中，所述kodmem/f12的体积分数为1％-84％，例如为1％-3％、3％-5％、5％-7％、7％-9％、9％-11％、11％-13％、13％-15％、15％-17％、17％-19％、19％-20％、20％-21％、21％-23％、23％-25％、25％-27％、27％-29％、29％-30％、30％-31％、31％-33％、33％-35％、35％-37％、37％-39％、39％-40％、40％-41％、41％-43％、43％-45％、45％-47％、47％-49％、49％-50％、50％-51％、51％-53％、53％-55％、55％-57％、57％-59％、59％-60％、60％-61％、61％-63％、63％-65％、65％-67％、67％-69％、69％-70％、70％-71％、71％-73％、73％-75％、75％-77％、77％-79％、79％-80％、80％-81％、81％-83％或83％-84％。
112.在一些实施方案中，所述kodmem/f12的体积分数为39.5％。
113.在一些实施方案中，所述b27 supplement的体积分数为0.1％-20％，例如为0.1％-0.5％、0.5％-1.0％、1.0％-1.1％、1.1％-1.3％、1.3％-1.5％、1.5％-1.7％、1.7％-1.9％、1.9％-2.0％、2.0％-2.1％、2.1％-2.3％、2.3％-2.5％、2.5％-2.7％、2.7％-2.9％、2.9％-3.0％、3.0％-3.1％、3.1％-3.3％、3.3％-3.5％、3.5％-3.7％、
3.7％-3.9％、3.9％-4.0％、4.0％-4.1％、4.1％-4.3％、4.3％-4.5％、4.5％-4.7％、4.7％-4.9％、4.9％-5.0％、5.0％-5.5％、5.5％-6.0％、6.0％-6.5％、6.5％-7.0％、7.0％-7.5％、7.5％-8.0％、8.0％-8.5％、8.5％-9.0％、9.0％-9.5％、9.5％-10％、10％-10.5％、10.5％-11％、11％-11.5％、11.5％-12％、12％-12.5％、12.5％-13％、13％-13.5％、13.5％-14％、14％-14.5％、14.5％-15％或15％-20％。
114.在一些实施方案中，所述b27 supplement的体积分数为4％。
115.在一些实施方案中，所述n2 supplement的体积分数为0.1％-10％，例如为0.1％-0.15％、0.15％-0.2％、0.2％-0.25％、0.25％-0.3％、0.3％-0.35％、0.35％-0.4％、0.4％-0.45％、0.45％-0.5％、0.5％-0.55％、0.55％-0.6％、0.6％-0.65％、0.65％-0.7％、0.7％-0.75％、0.75％-0.8％、0.8％-0.85％、0.85％-0.9％、0.9％-0.95％、0.95％-1.0％、1.0％-1.1％、1.1％-1.3％、1.3％-1.5％、1.5％-1.7％、1.7％-1.9％、1.9％-2.0％、2.0％-2.1％、2.1％-2.3％、2.3％-2.5％、2.5％-2.7％、2.7％-2.9％、2.9％-3.0％、3.0％-3.1％、3.1％-3.3％、3.3％-3.5％、3.5％-3.7％、3.7％-3.9％、3.9％-4.0％、4.0％-4.1％、4.1％-4.3％、4.3％-4.5％、4.5％-4.7％、4.7％-4.9％、4.9％-5.0％、5.0％-5.5％、5.5％-6.0％、6.0％-6.5％、6.5％-7.0％、7.0％-7.5％、7.5％-8.0％、8.0％-8.5％、8.5％-9.0％、9.0％-9.5％或9.5％-10％。
116.在一些实施方案中，所述n2 supplement的体积分数为1％。
117.在一些实施方案中，所述glutamax的体积分数为0.1％-10％，例如为0.1％-0.15％、0.15％-0.2％、0.2％-0.25％、0.25％-0.3％、0.3％-0.35％、0.35％-0.4％、0.4％-0.45％、0.45％-0.5％、0.5％-0.55％、0.55％-0.6％、0.6％-0.65％、0.65％-0.7％、0.7％-0.75％、0.75％-0.8％、0.8％-0.85％、0.85％-0.9％、0.9％-0.95％、0.95％-1.0％、1.0％-1.1％、1.1％-1.3％、1.3％-1.5％、1.5％-1.7％、1.7％-1.9％、1.9％-2.0％、2.0％-2.1％、2.1％-2.3％、2.3％-2.5％、2.5％-2.7％、2.7％-2.9％、2.9％-3.0％、3.0％-3.1％、3.1％-3.3％、3.3％-3.5％、3.5％-3.7％、3.7％-3.9％、3.9％-4.0％、4.0％-4.1％、4.1％-4.3％、4.3％-4.5％、4.5％-4.7％、4.7％-4.9％、4.9％-5.0％、5.0％-5.5％、5.5％-6.0％、6.0％-6.5％、6.5％-7.0％、7.0％-7.5％、7.5％-8.0％、8.0％-8.5％、8.5％-9.0％、9.0％-9.5％或9.5％-10％。
118.在一些实施方案中，所述glutamax的体积分数为1％。
119.在一些实施方案中，所述dmso的体积分数为5％-20％，例如为5％-6％、6％-7％、7％-8％、8％-9％、9％-10％、10％-11％、11％-12％、12％-13％、13％-14％、14％-15％、15％-16％、16％-17％、17％-18％、18％-19％或19％-20％。
120.在一些实施方案中，所述dmso的体积分数为10％。
121.在一些实施方案中，所述y27632的浓度为5-20μm，例如为5-6μm、6-7μm、7-8μm、8-9μm、9-10μm、10-11μm、11-12μm、12-13μm、13-14μm、14-15μm、15-16μm、16-17μm、17-18μm、18-19μm或19-20μm。
122.在一些实施方案中，所述y27632的浓度为10μm。
123.在一些实施方案中，所述人血清白蛋白(hsa)或胎牛血清的体积分数为1％-10％，例如为1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-6％、6％-7％、7％-8％、8％-9％或9％-10％。
124.在一些实施方案中，所述人血清白蛋白(hsa)或胎牛血清的体积分数为5％。
125.需要说明的是，所述神经细胞球冻存液中各组分的浓度为各组分在所述神经细胞球冻存液中的终浓度，所述神经细胞球冻存液中各组分的体积分数为各组分的体积/所述神经细胞球冻存液的总体积。
126.在本发明的第五方面，本发明提供了制备前述的神经细胞球冻存制剂的方法，其包括：
127.将前述的神经细胞球进行离心处理，弃上清，获得神经细胞球沉淀；
128.将所述神经细胞球沉淀与神经细胞球冻存液进行混合，使所述神经细胞球重悬于所述神经细胞球冻存液，获得细胞球重悬液，所述细胞球重悬液为所述神经细胞球冻存制剂。
129.在一些实施方案中，所述神经细胞球冻存液中，所述神经细胞球的细胞总密度为105/ml～107/ml，例如为1
×
105/ml～3
×
105/ml、3
×
105/ml～5
×
105/ml、5
×
105/ml～7
×
105/ml、7
×
105/ml～1
×
106/ml、1
×
106/ml～3
×
106/ml、3
×
106/ml～5
×
106/ml、5
×
106/ml～7
×
106/ml或7
×
106/ml～1
×
107/ml。
130.在一些实施方案中，所述神经细胞球冻存液中，所述神经细胞球的细胞总密度为3
×
106/ml。
131.在一些实施方案中，所述神经细胞球冻存液如前所述。
132.在一些实施方案中，所述方法进一步包括：将所述细胞球重悬液进行冷冻处理，之后置于液氮中进行保存。
133.在一些实施方案中，所述冷冻处理是在温度为-80℃以下的条件下进行8-15小时(过夜)。
134.在一些实施方案中，所述神经细胞球冻存液预先经过冷藏处理。
135.在一些实施方案中，所述冷藏处理是在温度为0-4℃的条件下进行的。
136.在本发明的第六方面，本发明提供了神经细胞球冻存制剂，其由前述的方法制备得到。
137.在本发明的第七方面，本发明提供了前述的神经细胞球或者前述的神经细胞球制剂在制备试剂或药物中的用途，所述试剂或药物用于选自以下的一种或多种：
138.(1)用于神经细胞移植；
139.(2)用于治疗神经退行性疾病。
140.在一些实施方案中，所述神经退行性疾病为帕金森病。
141.在本发明的第八方面，本发明提供了前述的神经细胞球或者前述的神经细胞球制剂，其用于选自以下的一种或多种：
142.(1)用于神经细胞移植；
143.(2)用于治疗神经退行性疾病。
144.在一些实施方案中，所述神经退行性疾病为帕金森病。
145.在本发明的第九方面，本发明提供了神经细胞移植方法或治疗神经退行性疾病的方法，其包括：将有效量的前述的神经细胞球移植到哺乳动物纹状体或神经组织中；或者，将前述的神经细胞球制剂进行复苏，得到前述的神经细胞球，之后将有效量的所述神经细胞球移植到哺乳动物纹状体或神经组织中。
146.在一些实施方案中，所述神经退行性疾病为帕金森病。
147.在本发明的第十方面，本发明提供了体外制备神经元的方法，其包括：在适于前述的神经细胞球进行分化的条件下培养前述的神经细胞球。
148.在本发明的第十一方面，本发明提供了神经元，其由前述的方法制备得到。
149.本发明中，术语“哺乳动物”包括牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物等，例如是人、小鼠、大鼠、狗、猪或猴等。在某些实施方案中，哺乳动物指非人哺乳动物。在另一些实施方案中，哺乳动物指人。
150.本发明中，术语“有效量”是指在合理的医学判断范围内，足以治疗患者疾病但足够低地避免严重副作用(在合理的利益/风险比)的量。治疗有效量将根据所治疗的疾病的严重性、所治疗的患者的年龄、大小、体重和身体疾病、所治疗的患者的医疗史、治疗持续时间、并行疗法的性质、所需的治疗效果等因素发生变化，但仍可以由本领域技术人员常规确定。
151.有益效果
152.本发明的技术方案具有以下一种或多种优势：
153.1、通过将神经相关细胞(如多巴胺神经细胞)悬浮成球的制剂方式可以实现以下目的的一种或多种：
154.(1)提高神经相关细胞(如多巴胺神经细胞)的突触完整性；
155.(2)实现神经相关细胞(如多巴胺神经细胞)新形式的冻存；
156.(3)促进或提高神经相关细胞(如多巴胺神经细胞)的体内存活；
157.(4)可能应用的领域：神经细胞移植。
158.2、当本发明的神经球的直径控制在某一范围内时，神经细胞球(如多巴胺(da)神经球)能够实现以下目的的一种或多种：
159.(1)在冻存液中保存12周并维持较好的活率(例如80％以上，或如85％以上)；
160.(2)在冻存液中保存6周并维持较好的活率(例如85％以上，或如90％以上)；
161.(3)在冻存液中保存6周或12周后，细胞状态良好，细胞球边缘光滑，几乎无死细胞；
162.(4)在冻存12周后仍然保持较高的活力(如90％以上)；
163.(5)在冻存液中保存6周或12周后，神经元的骨架不会被伤害，冻存后的神经细胞球中的tuj1比例仍维持在较高的范围(如70％左右)；
164.(6)在冻存液中保存1个月后，神经细胞球仍然具有贴壁能力，细胞贴壁率较高(如为80％)；
165.(7)神经细胞球移植后在体内的存活能力显著强于将单细胞，神经细胞球移植的细胞存活数目是单细胞移植的4倍或以上。
附图说明
166.图1表示本发明实施例制备的神经细胞球在光学显微镜下的检测图，标尺＝200μm。
167.图2表示本发明实施例复苏后的神经细胞球(直径80-120μm)状态，标尺＝100μm。
168.图3表示本发明实施例冻存6周的神经细胞球(直径80-120μm)活率。
169.图4表示本发明实施例冻存12周的神经细胞球(直径80-120μm)活率。
170.图5表示本发明实施例复苏后的神经细胞球(直径120-200μm)状态，标尺＝200μm。
171.图6表示本发明实施例冻存6周的神经细胞球(直径120-200μm)活率。
172.图7表示本发明实施例冻存12周的神经细胞球(直径120-200μm)活率。
173.图8表示本发明实施例复苏后的神经细胞球(直径180-300μm)状态，标尺＝200μm。
174.图9表示本发明实施例冻存6周的神经细胞球(直径180-300μm)活率。
175.图10表示本发明实施例冻存6周的神经细胞球(直径小于80μm)活率。
176.图11表示本发明实施例新鲜与冻存的神经细胞球(直径120-200μm)标志物的染色。
177.图12表示本发明实施例冻存后神经细胞球(直径120-200μm)的贴壁培养。
178.图13表示单细胞制剂与本发明实施例神经细胞球的移植结果比较。
具体实施方式
179.下面详细描述本发明的实施例，下面描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
180.除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照j.sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及f.m.ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，john wiley&sons,inc.，1995中所述的方法进行。除非特别指明，本发明中所使用的试剂均可以市购获得。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
181.实施例1
182.1.实验步骤
183.1.1神经细胞球的形成及培养：
184.a)培养基的配制：
185.b27培养基的配制：97％neurobasal-cts+2％b27-supplement+1％glutamax-cts；
186.d17-25培养基的配制：b27培养基+bdnf(20ng/ml)+gdnf(20ng/ml)+tgf-β3(1ng/ml)+aa(0.2mm)+db-camp(0.5mm)+dapt(10μm)
187.b)细胞消化：将多巴胺神经前体细胞用tryple或accutase消化成单细胞，之后加入新鲜培养基(d17-25培养基)吹打成细胞悬液，取10μl上述细胞悬液加入到10μl台盼蓝溶液中混匀，利用countess细胞计数仪进行计数；
188.c)细胞接种：将上述细胞悬液按照不同细胞量(5
×
104/孔，1
×
105/孔，5
×
105/孔，1
×
106/孔)接种到底部有凹陷图案的低贴附培养板aggrewell
tm 400 24-well plate中，接种培养基为含10μm y27632的d17-25培养基；
189.d)细胞球的形成：接种的多巴胺神经前体细胞在aggrewell
tm 400 24-well plate中可形成不同直径大小的神经细胞球：5
×
104/孔可形成直径小于80μm的神经细胞球，1
×
105/孔可形成直径80-120μm的神经细胞球，5
×
105/孔可形成直径120-200μm的神经细胞球，1
×
106/孔可形成直径180-300μm的神经细胞球；
190.e)细胞球的培养：隔天半量更换培养基，在多巴胺成熟培养基的处理下可以使神经前体细胞继续向成熟神经元分化。
191.1.2神经细胞球的冻存实验：
192.a)冻存液的配制：39.5％neurobasal-cts+39.5％kodmem/f12-cts+4％b27supplement+1％n2 supplement-cts+1％glutamax-cts+10％dmso+5％hsa+y27632(10μm)。用1ml移液枪吹打10次混匀后，放到4℃冰箱预冷备用；同时也将程序降温盒放到4℃冰箱预冷备用；
193.b)细胞球的收集：将制备获得的神经细胞球收集到15ml离心管中，800rpm/min室温离心3min；
194.c)细胞球重悬：弃掉上清，加入预冷好的上述冻存液重悬细胞，重悬后的细胞球的细胞密度约是3
×
106/ml；
195.d)细胞球梯度冻存：将上述细胞悬液按照1ml/管分装到冻存管中，然后将冻存管放入冻存盒中，-80℃冰箱过夜，第二天转入液氮中长期保存。
196.1.3神经细胞球的复苏
197.a)提前打开细胞复苏仪预热；
198.b)在生物安全柜中准备15ml离心管，加入9ml生理盐水，待用；
199.c)液氮中取出一支上述冻存的神经细胞球，迅速放入细胞复苏仪中快速解冻；
200.d)75％酒精擦拭冻存管，吸取冻存液加入准备好的生理盐水中，室温800r/min离心3min；弃掉上清，继续加入生理盐水清洗两次。
201.e)弃掉上清，加入上述d17-25培养基+y27632(10μm)培养基重悬神经细胞球，然后接种于低贴附的六孔板中，每孔加入3ml d17-25培养基+y27632(10μm)培养基，放入37℃、5％co2培养箱中培养。
202.1.4神经细胞球复苏后的活率检测
203.a)提前打开细胞复苏仪预热；
204.b)在生物安全柜中准备15ml离心管，加入9ml生理盐水，待用；
205.c)液氮中取出一支冻存的神经细胞球，迅速放入细胞复苏仪快速解冻；
206.d)75％酒精擦拭冻存管，吸取冻存液加入准备好的生理盐水中，室温800r/min离心3min；弃掉上清，继续加入生理盐水清洗两次。
207.e)清洗完后吸弃上清加入tryple，于37℃、5％co2培养箱中孵育15min(可适当延长或缩短消化时间)；用移液枪轻轻吹打da细胞球成单细胞，用生理盐水终止消化，室温1200r/min离心3min；
208.f)弃掉上清，用生理盐水重悬细胞；取10μl细胞悬液加入到10μl台盼蓝溶液中混匀，用countess计数仪检测细胞密度和细胞活率。
209.1.5神经细胞球复苏后的贴壁率检测实验
210.a)vitronectin基质的配制：室温下，吸取6ml dpbs加入至15ml离心管中，然后吸取60μl vitronectin加入至上述dpbs中，移液枪吹打10次混匀，得到vitronectin基质，现用现配。六孔板每孔加入1ml配好的基质，室温孵育1h备用。
211.b)在生物安全柜中准备15ml离心管，加入9ml上述b27培养基，待用；
212.c)液氮中取出一支冻存的神经细胞球，迅速放入细胞复苏仪快速解冻；
213.d)75％酒精擦拭冻存管，吸取冻存液加入准备好的b27培养基中，室温800r/min离心3min；
214.e)弃掉上清，加入上述d17-25培养基+y27632(10μm)培养基重悬神经细胞球，然后接种于低贴附的六孔板中，每孔加入3ml d17-25培养基+y27632(10μm)培养基，放入37℃、5％co2培养箱中培养，隔天半量换液。
215.f)待复苏的细胞完全铺展于培养板，弃掉培养基，dpbs清洗一遍后，用tryple消化5min(可适当延长或缩短消化时间)，收集后用countess细胞计数仪检测贴壁的细胞数目，进一步计算细胞贴壁率(贴壁率＝贴壁细胞数目/接种细胞数目)。
216.1.6免疫荧光染色
217.a样品处理：
218.a)将待鉴定的神经细胞球用包含4％多聚甲醛室温下固定30分钟；
219.用pbs洗涤3次，然后再30％蔗糖溶液中4℃脱水过夜；
220.b)oct包埋：先用pbs清洗一遍除去表面蔗糖。然后将样品放入盛有oct的包埋盒中进行包埋，注意样品的位置，尽量避免气泡。
221.c)液氮速冻：用镊子夹住包埋盒，小心地使包埋盒底面接触液氮，切勿直接浸没以免降温过快温度不均导致样品碎裂。待oct凝固后将包埋块放入-80℃冰箱中降温30分钟或储存备用。
222.d)切片：将样品拿到冷冻切片机中平衡，调整切片机的温度在-20℃。然后用徕卡sm2010r切片机进行切片，用多聚赖氨酸包被的载玻片贴片，最后放于-80℃冰箱中保存或染色处理。
223.b染色：
224.a)切片完后，进行免疫荧光染色。首先将切片用pbs冲洗3次，每次10分钟；
225.b)封闭：每孔加入2％bsa和0.3％triton的混合溶液320μl，室温封闭2h；
226.c)加一抗：用2％bsa和0.3％triton的混合溶液稀释一抗(抗体信息：mouse anti-tubb3(biolegend，801202，1:500)，rabbit anti-caspase-3(cell signaling，9661s，1:400))，吹打混匀后，弃去封闭液，每孔加入320μl一抗稀释液，封口膜封口后，4℃过夜；
227.d)加二抗：吸弃一抗后，用pbs洗2次；每孔加入320μl的2％bsa和0.3％triton混合溶液稀释的二抗(mouse cy3(1:200)；rat cy3(1:200))，避光室温放置2h；
228.e)染核：弃去二抗，用pbs洗2次；每孔加入320μl的hoechst33342稀释液(1ml pbs中加1ul hoechst33342)，孵育细胞15min；
229.f)封片：pbs清洗一遍后，然后用封片剂封片；
230.g)图像拍摄：所有图像均由共聚焦显微镜(zeiss lsm 780)拍摄。
231.1.7细胞移植及存活能力检测
232.a.神经细胞球的体内移植
233.a)神经细胞球的收集：将悬浮培养的神经细胞球全部收集至50ml离心管中，若孔内仍有残留神经细胞球，用pbs冲洗，并将冲洗液一同收集至到离心管中，800rpm/min室温离心3min；
234.b)神经细胞球重悬：弃掉上清，加入细胞注射液轻轻重悬细胞；
235.c)神经细胞球移植：每只动物注射2.5
×
105上述神经细胞球于纹状体，纹状体坐标为anterior(a)，0.6mm；lateral(l)，-2mm；ventral(v)，-4mm；注射速度1μl/min，注射后原位留针5min，缝合伤口。
236.b.神经细胞球在体内存活能力的检测
237.样品处理：
238.a)取材：三个月后，动物处死并取脑；
239.b)固定：将新鲜的鼠脑组织放入4％多聚甲醛中，4℃固定过夜；
240.c)梯度脱水：用pbs清洗3遍，每次清洗5min；然后用pbs配制的15％、30％蔗糖溶液在4℃条件下梯度脱水至样品下沉；
241.d)oct包埋：先用pbs清洗一遍除去表面蔗糖。然后将样品放入盛有oct的包埋盒中进行包埋。
242.e)液氮速冻：用镊子夹住包埋盒，接触液氮，待oct凝固后将包埋块放入-80℃冰箱中降温30分钟或储存备用。
243.切片：将样品拿到冷冻切片机中平衡，调整切片机的温度在-20℃。然后用徕卡sm2010r切片机进行切片，切片厚度为12-15μm，用多聚赖氨酸包被的载玻片贴片，最后放于-80℃冰箱中保存或染色处理。
244.组织染色：
245.a)将切片从冰箱取出，室温条件下干燥15-30min；
246.b)抗原修复：先用pbs清洗3次，每次5min。然后把玻片浸于修复液中，微波炉加热10min。取出后，室温冷却30min；
247.c)然后用pbs清洗3次，每次5min；擦干组织周围的pbs，用组化笔在组织周围画圈；
248.d)封闭：每孔加入2％bsa和0.3％triton的混合溶液320μl，室温封闭2h；
249.e)加一抗：用2％bsa和0.3％triton的混合溶液稀释一抗，吹打混匀后，弃去封闭液，每孔加入320μl一抗稀释液，封口膜封口后，4℃过夜；
250.f)加二抗：吸弃一抗后，用pbs洗2次；每孔加入320μl的2％bsa和0.3％triton混合溶液稀释的二抗，避光室温放置2h；
251.g)染核：弃去二抗，用pbs洗2次；每孔加入320μl的hoechst33342稀释液(1ml pbs中加1ul hoechst33342)，孵育细胞10-15min；
252.h)封片：pbs清洗一遍后，然后用封片剂封片；在组织上滴加10μl防荧光猝灭剂，盖载玻片并固定。
253.i)图像拍摄：所有图像均由共聚焦显微镜(zeiss lsm 780)拍摄。
254.1.8细胞状态检测
255.将接种24h或者复苏24h的神经细胞球放于倒置光学显微镜下肉眼观察神经细胞球的状态，并拍照记录。
256.2.实验结果
257.2.1不同直径大小的神经细胞球的制备
258.通过上述方法在aggrewell
tm 400 24-well plate中接种不同的细胞量来制备不同直径大小的神经细胞球：5
×
104/孔可形成直径小于80μm的神经细胞球，1
×
105/孔可形成直径80-120μm的神经细胞球，5
×
105/孔可形成直径120-200μm的神经细胞球，1
×
106/孔可形成直径180-300μm的神经细胞球。制备的神经细胞球如图1所示。
259.2.2神经细胞球(直径80-120μm)复苏后的细胞状态
260.将上述神经细胞球(直径80-120μm)冻存6周后的细胞状态如图2所示，结果显示细
胞状态良好，细胞球边缘光滑，几乎无死细胞。
261.2.3冻存6周后神经细胞球(直径80-120μm)活率的检测结果
262.将冻存6周的神经细胞球(直径80-120μm)tryple消化后，用countess细胞计数仪检测细胞数目和细胞活率，检测结果如图3所示，结果显示冻存6周的神经细胞的活率在90％以上。
263.2.4冻存12周后神经细胞球(直径80-120μm)活率的检测结果
264.将冻存12周的神经细胞球(直径80-120μm)tryple消化后，用countess细胞计数仪检测细胞数目和细胞活率。检测结果如图4所示，结果显示冻存12周的神经细胞球的活率在85％以上。
265.2.5神经细胞球(直径120-200μm)复苏后的细胞状态
266.将神经细胞球(直径120-200μm)冻存6周后的细胞状态如图5所示，结果显示细胞状态良好，细胞球边缘光滑，几乎无死细胞。
267.2.6冻存6周后神经细胞球(直径120-200μm)活率的检测结果
268.将冻存6周的神经细胞球(直径120-200μm)tryple消化后，用countess细胞计数仪检测细胞数目和细胞活率，检测结果如图6所示，结果显示冻存6周的神经细胞的活率在85％以上。
269.2.7冻存12周后神经细胞球(直径120-200μm)活率的检测结果
270.将冻存12周的神经细胞球(直径120-200μm)tryple消化后，用countess细胞计数仪检测细胞数目和细胞活率，检测结果如图7所示，结果显示冻存12周的神经细胞的活率在80％以上。
271.2.8神经细胞球(直径180-300μm)复苏后的细胞状态
272.将神经细胞球(直径180-300μm)冻存6周后的细胞状态如图8所示，结果显示细胞球中间颜色较深，部分细胞可能发生死亡。
273.2.9冻存6周后神经细胞球(直径180-300μm)活率的检测结果
274.将冻存6周的神经细胞球(直径180-300μm)tryple消化后，用countess细胞计数仪检测细胞数目和细胞活率，检测结果如图9所示，结果显示冻存6周的神经细胞的活率低于60％。
275.2.10冻存6周后神经细胞球(直径小于80μm)活率的检测结果
276.将冻存6周的神经细胞球(直径小于80μm)tryple消化后，用countess细胞计数仪检测细胞数目和细胞活率，检测结果如图10所示，结果显示冻存6周的神经细胞的活率低于65％。
277.2.11新鲜与冻存的神经细胞球(直径120-200μm)标志物的比较
278.以新鲜的神经细胞球作为对照，冻存12周的神经细胞球中死细胞的数量(caspase3的比例)小于5％(图11)，说明神经细胞球能够在冻存12周后仍然保持90％以上的活力。
279.另外，tuj1是一种被认为参与神经元细胞类型特异性分化的微管蛋白。微管蛋白是微管的主要结构，是细胞骨架的组成成分，在细胞结构的维护，有丝分裂，减数分裂，细胞内的运输等等方面发挥作用。所以对冻存前后神经元微管蛋白的标志物tuj1进行了免疫荧光的鉴定，结果证明，神经细胞球中tuj1+的神经细胞比例约70％，且冻存后的神经细胞球
中的tuj1比例仍维持在70％左右(图11)，说明神经细胞球的冻存没有对神经元的骨架造成伤害。
280.2.12神经细胞球(直径120-200μm)复苏后贴壁率的检测
281.将冻存1个月后的神经细胞球进行贴壁培养发现，冻存后的神经细胞球仍然具有贴壁能力，细胞贴壁率为80％(图12)。
282.2.13神经细胞球(直径120-200μm)在动物体内的存活能力检测
283.单细胞制剂：即上述1.1的步骤b)中获得的细胞悬液。
284.神经球制剂：即上述1.1的步骤d)中获得的直径120-200μm神经细胞球。
285.且单细胞制剂和神经球制剂中的细胞总数基本相同。
286.将单细胞制剂与神经细胞球制剂在体内的存活能力进行了比较，切片结果显示神经细胞球的制剂形式有利于神经细胞在体内的存活，统计结果发现神经细胞球移植的细胞存活数目是单细胞移植的4倍(图13)。
287.以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。