一种马活体采卵方法及所用的制剂与流程

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种马活体采卵方法及所用的制剂。


背景技术：

2.由于自然条件限制，我国马的繁殖主要仍然沿袭传统的群牧自然交配方式，繁殖率低，公马优良种源极度缺乏，良马种群扩展速度慢，成本高。马的体细胞克隆时，需要一定量的成本低、质量好的卵母细胞，去核后注入体细胞，电激后形成胚胎，然后移植到母马体内，可以快速扩充良马的种群。但是体细胞克隆需要大量的质量好的卵母细胞。
3.活体取卵是一项可反复从活体获取卵母细胞的技术。该技术能够扩大卵的来源，结合卵母细胞体外成熟培养(ivm)、体细胞克隆和早期胚胎培养(ivc)可产生大量可移植优质品种的胚胎。另外，活体取卵能够克服从屠宰卵巢采集卵母细胞的质量不稳定，需要运输、来源不稳定等缺点。
4.但是，现有技术中，从母马人工活体取卵时，一次只能从马体内取出一个卵母细胞，少数马匹可以取出2个卵母细胞，有的马匹，甚至一个也取不出来，其他的卵母细胞未发育到相对成熟的状态，卵母细胞与卵泡的连接较为紧密，采用常规的技术手段用负压泵吸取时，卵母细胞很难从卵泡上脱落，耗费了较大的人力和物力，一次从一匹母马上获得的卵母细胞较少，造成成本的上升。因此亟需一种一次可以从母马体内取出更多卵母细胞的取卵装置及取卵方法。


技术实现要素：

5.因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的马活体采卵效率低下的缺陷，从而提供一种效率高的马活体采卵方法及所用的制剂。
6.一种用于马活体采卵的采卵液制剂，包括如下重量份的组分：1000份的dpbs缓冲液；3-13.5份的蛋白酶。
7.进一步的，所述蛋白酶为胶原酶、透明质酸酶和链霉蛋白酶中的一种或几种。
8.进一步的，所述蛋白酶为胶原酶、透明质酸酶和链霉蛋白酶的混合物，其中胶原酶为1-4.5份，透明质酸酶为1-4份，链霉蛋白酶为1-4份。
9.进一步的，胶原酶为2.5份，透明质酸酶为2份，链霉蛋白酶为1份。
10.基于上述采卵液的马活体采卵方法，包括如下步骤：
11.s1:将母马进行保定后麻醉，外阴消毒处理；
12.s2：操作人员一手握住b超探头柄部，将其轻缓插入阴道穹隆处，另一手伸入直肠，从直肠握住卵巢，将其置于探头上，移动卵巢，通过b超屏幕观察卵巢的结构和大小，并选定目标卵泡，取卵针针头刺破阴道壁和卵泡壁，用脚踏开关控制真空泵，用取卵针将母马卵巢上的卵泡中的液体吸出来，储存在收集管中；
13.s3：将采卵液通过取卵针注射到卵泡中，让卵泡恢复原来大小；
14.s4：重复步骤s2和s3的次数为1-5次；
15.s5：选定下一个目标卵泡，重复步骤s2到s4，直到这匹马卵巢上合适的卵泡采集完。
16.进一步的，步骤s3中，将卵泡恢复到原来大小的85％-110％。
17.进一步的，步骤s3中，将卵泡恢复到原来大小的110％。
18.进一步的，步骤s3中，将卵泡恢复到原来大小的85％。
19.本发明技术方案，具有如下优点：采用本发明的采卵方法，一匹母马单次可以采卵可以获得更多的卵母细胞，提高了经济效率，降低了成本。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
21.图1是本发明实施例1中的一种马活体采卵方法的流程图；
具体实施方式
22.提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
23.实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
24.实施例1-x
25.一种用于马活体采卵的采卵液制剂，包括如下重量份的组分：1000份的dpbs缓冲液；3-13.5份的蛋白酶。其中，所述蛋白酶为：胶原酶为2.5份，透明质酸酶为2份，链霉蛋白酶为1份。
26.基于上述采卵液的马活体采卵方法，选出5匹5-10岁的母马，对每匹马的取卵步骤包括如下步骤：
27.s1:将母马进行保定麻醉，外阴消毒处理；
28.s2：操作人员一手握住b超探头柄部，将其轻缓插入阴道穹隆处，另一手伸入直肠，从直肠握住卵巢，将其置于探头上，移动卵巢，通过b超屏幕观察卵巢的结构和大小，并选定目标卵泡，取卵针针头刺破阴道壁和卵泡壁，用脚踏开关控制真空泵，用取卵针将母马卵巢上的卵泡中的液体吸出来，储存在收集管中；
29.s3：将采卵液通过取卵针注射到卵泡中，让卵泡恢复原来大小；
30.s4：重复步骤s2和s3的次数为1-5次；
31.s5：选定下一个目标卵泡，重复步骤s2到s4，直到这匹马卵巢上的目标卵泡采集完，进行下一匹马，目标卵泡通常要在2mm以上。
32.最后，将将采集的卵泡液立即用洗卵液稀释，倒入胚胎滤器中，反复洗涤3-4次，最
后将滤器中的液体及沉淀物倒入培养皿中，在解剖镜下检出采集的卵母细胞。
33.对比例1-y
34.s1:将母马进行保定麻醉，外阴消毒处理；
35.s2：操作人员一手握住b超探头柄部，将其轻缓插入阴道穹隆处，另一手伸入直肠，从直肠握住卵巢，将其置于探头上，移动卵巢，通过b超屏幕观察卵巢的结构和大小，并选定目标卵泡，取卵针针头刺破阴道壁和卵泡壁，用脚踏开关控制真空泵，用取卵针将母马卵巢上的卵泡中的液体吸出来，储存在收集管中；
36.s3：将dpbs缓冲液通过取卵针注射到卵泡中，让卵泡恢复原来大小；
37.s4：重复步骤s2和s3的次数为1-5次；
38.s5：选定下一个目标卵泡，重复步骤s2到s4，直到这匹马卵巢上合适的卵泡采集完。
39.最后，将采集的卵泡液立即用洗卵液稀释，倒入胚胎滤器中，反复洗涤3-4次，最后将滤器中的液体及沉淀物倒入培养皿中，在解剖镜下检出采集的卵母细胞。
40.两次试验获得的卵母细胞数如下表：
41.表1-1
[0042][0043][0044]
从上述试验数据可以看出，采用本发明的消化消消液进行马的活体采卵，可以比传统方法获得更多的马的卵母细胞，效率提升超过了100％。
[0045]
实施例2：马的匹数为3，采卵液的质量份组成为dpbs缓冲液1000份，胶原酶为1份，透明质酸酶为1份，链霉蛋白酶为1份，其余同实施例1处理。
[0046]
获得的卵母细胞如下表：
[0047]
表1-2
[0048][0049]
实施例3：马的匹数为3，采卵液的质量份组成为dpbs缓冲液1000份，胶原酶为4.5份，透明质酸酶为1份，链霉蛋白酶为1份，其余同实施例1处理。
[0050]
获得的卵母细胞如下表：
[0051]
表1-3
[0052][0053][0054]
实施例4：马的匹数为3，采卵液的质量份组成为dpbs缓冲液1000份，胶原酶为4.5份，透明质酸酶为4份，链霉蛋白酶为1份，其余同实施例1处理。
[0055]
获得的卵母细胞数量如下表：
[0056]
表1-4
[0057][0058]
实施例5：马的匹数为3，采卵液的质量份组成为dpbs缓冲液1000份，胶原酶为4.5份，透明质酸酶为4份，链霉蛋白酶为4份，其余同实施例1处理。
[0059]
获得的卵母细胞如下表：
[0060]
表1-5
[0061]
[0062][0063]
实施例6：马的匹数为.3，采卵液的质量份组成为dpbs缓冲液1000份，胶原酶为2份，透明质酸酶为3份，链霉蛋白酶为1份，其余同实施例1处理。
[0064]
获得的卵母细胞如下表：
[0065]
表1-6
[0066][0067]
从上述实施例2-6可以看出，采用本发明实施例的采卵液进行活体采卵时，每匹马上可以获得2-3颗卵子，比传统的平均1个多点相比，大大提高了取卵效率，降低了取卵的成本。
[0068]
实施例7
[0069]
本发明的试剂成份，还可以采用如下的试剂成份，一种用于马活体采卵的采卵液制剂包括如下重量份的组分：dpbs缓冲液、份胶原酶、透明质酸酶和链霉蛋白酶的质量份配比如下表。
[0070]
表1-7
[0071]
配方dpbs缓冲液胶原酶透明质酸酶链霉蛋白酶110002.52121000111310004.541410004.544510002316100014471000232
[0072]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。