Derp2的4个B细胞表位肽及其应用的制作方法

本发明属于免疫治疗领域，具体涉及der p2的4个b细胞表位肽及其应用。

背景技术：

1、近年来，我国尘螨、花粉等吸入性过敏原引起的呼吸道过敏性疾病的发病率呈上升趋势，已超过10％，严重危害患者健康。呼吸道过敏性疾病发病机制为外源性致敏原引起的，机体呼吸道黏膜以2型辅助t(th2)细胞极化为特征，并伴有免疫耐受异常的过敏性炎症。目前，临床上应用的过敏原特异性疗法(ait)是唯一能够干预过敏性疾病自然进程的对因治疗方法，然而，其疗程长，患者依从性差，安全性也有待进一步提高。

2、在呼吸道过敏性疾病ait治疗策略研究方面，为避免其带来的副作用，进一步提高安全性及疗效，建立在过敏原序列分析基础上，新型重组过敏原疫苗、基因疫苗、表位疫苗的研究已成为近年来的研究热点。但是，这些疫苗存在一些不足，如重组过敏原疫苗和t细胞表位疫苗，容易引起迟发性t细胞反应性，治疗效果不理想。

3、尘螨抗原作为主要的吸入性过敏原，其中过敏性哮喘患者血清阳性率最高的是der p2、der p1、der f2、der f1。因此，提出针对上述尘螨过敏原的疫苗对于治疗呼吸道过敏性疾病具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。经生物信息学分析，将过敏原序列中与免疫球蛋白e(ige)结合的b细胞表位肽融合于非致敏性载体蛋白上，构建的新型b细胞表位疫苗可避免重组过敏原疫苗、t细胞表位疫苗等带来的副作用，已成为了目前过敏性疾病ait治疗的新策略。

2、基因疫苗是将编码某种抗原的外源基因(dna或rna)直接导入动物体细胞内，通过宿主细胞表达系统合成抗原，诱导宿主产生对该抗原的免疫应答，以达到防治疾病目的的一类新型疫苗。在预防和治疗肿瘤、感染型疾病等方面已有多种基因疫苗显示出了强大的应用潜力。尘螨抗原作为主要的吸入性过敏原，其中过敏性哮喘患者血清阳性率最高的是der p2、der p1、der f2、der f1。尘螨抗原der p2的重组b细胞表位肽因其ige、ⅱ型辅助性t细胞(th2)反应性弱，有望作为靶抗原被der p2特异性b细胞识别，从而成为呼吸道过敏性疾病治疗的靶点。

3、为此，本发明提出der p2的4个b细胞表位肽或包含所述4个b细胞表位肽的多肽，不引起过敏患者血清特异性ige反应。

4、本发明还提出一种核酸分子。

5、本发明还提出一种载体。

6、本发明还提出一种宿主细胞。

7、本发明还提出一种疫苗。

8、本发明还提出所述疫苗在制备治疗呼吸道过敏性疾病的产品中的应用。

9、根据本发明的一个方面，提出了der p2的4个b细胞表位肽或包含所述4个b细胞表位肽的多肽，所述4个b细胞表位肽分别为氨基酸序列如seq id no:1所示的p1肽段，氨基酸序列如seq id no:2所示的p2肽段，氨基酸序列如seq id no:3所示的p3肽段，氨基酸序列如seq id no:4所示的p4肽段。

10、根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：

11、本发明选取的4个b细胞表位肽位于尘螨过敏原der p2的ige识别区，即b细胞表位区。且4个b细胞表位肽或包含4个b细胞表位肽的多肽均具有低的t细胞反应性，诱导b细胞产生der p2特异性的igg抗体，能够中和ige，因此不引起尘螨过敏患者血清特异性的ige反应，适用于治疗呼吸道过敏性疾病。

12、具体地，所述p1肽段选自der p2的16至33位氨基酸。

13、具体地，所述p2肽段选自der p2的87至106位氨基酸。

14、具体地，所述p3肽段选自der p2的102至121位氨基酸。

15、具体地，所述p4肽段选自der p2的73至92位氨基酸。

16、在本发明的一些实施方式中，seq id no:1为rdqvdvkdcanheikkvl。

17、在本发明的一些实施方式中，seq id no:2为nachymkcplvkgqqydiky。

18、在本发明的一些实施方式中，seq id no:3为ydikytwnvpkiapksenvv。

19、在本发明的一些实施方式中，seq id no:4为sidglevdvpgidpnachym。

20、在本发明的一些实施方式中，所述4个b细胞表位肽或包含所述4个b细胞表位肽的多肽均表现出ige低反应性。

21、在本发明的一些实施方式中，所述多肽包括所述4个b细胞表位肽和载体蛋白，所述4个b细胞表位肽和所述载体蛋白相连。

22、具体地，所述4个b细胞表位肽与所述载体蛋白的连接没有固定顺序。

23、在本发明的一些实施方式中，所述载体蛋白选自乙型肝炎病毒外膜蛋白s(pres)、乙型肝炎病毒外膜蛋白前s1(pres1)或乙型肝炎病毒外膜蛋白前s2(pres2)。

24、在本发明的一些优选的实施方式中，所述载体蛋白选自pres。

25、具体地，所述der p2的4个b细胞表位肽连接至所述载体蛋白上形成复合物。这样可以提高所述多肽的免疫原性，以增强针对尘螨过敏原der p2的免疫反应。

26、具体地，所述多肽的结构为：p2-p1-pres-p3-p4。各肽段之间通过连接序列相连。

27、根据本发明的第二个方面，提出了一种核酸分子，包括编码所述der p2的4个b细胞表位肽或多肽的dna或mrna。

28、根据本发明的第三个方面，提出了一种载体，包括所述核酸分子。

29、在本发明的一些实施方式中，所述载体为表达载体。

30、具体地，包括所述核酸分子的载体可用于克隆或用于生产表达载体，所述载体可以是质粒、病毒、噬菌体或任何其他遗传工程中通常使用的载体。

31、具体地，所述载体除了包括所述核酸分子外，还可包括用于控制表达的真核或原核元件，如用于启动和终止转录和/或翻译的调节序列、增强子、启动子、信号序列等。

32、在本发明的一些实施方式中，所述载体包括细菌、真菌、昆虫、病毒或哺乳动物载体。

33、根据本发明的第四个方面，提出了一种宿主细胞，包括所述核酸分子或所述载体，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。

34、具体地，所述核酸分子和所述载体可被引入合适的宿主细胞。所述核酸分子可被引入所述宿主细胞的基因组；所述载体可在胞质中以染色体外的形式存在或被并入所述宿主细胞的染色体中。

35、在本发明的一些实施方式中，所述原核细胞为细菌细胞。

36、在本发明的一些实施方式中，所述真核细胞包括酵母细胞、丝状真菌细胞、哺乳动物细胞或昆虫细胞。

37、根据本发明的第五个方面，提出了疫苗，包括所述der p2的4个b细胞表位肽或多肽、所述核酸分子、所述载体中的至少一种。

38、根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：

39、本发明的疫苗是过敏原b细胞表位疫苗，可诱导b细胞产生过敏原特异性igg中和抗体，抑制ige产生，促进抗原特异性b细胞分化及th1型细胞反应，与重组过敏原疫苗、t细胞表位疫苗相比，不引起迟发性t细胞反应性，具有良好的治疗效果。

40、在本发明的一些实施方式中，所述疫苗还包括佐剂或赋形剂。

41、在本发明的一些实施方式中，所述疫苗以多相乳液或微球中的至少一种形式存在。

42、在本发明的一种实施方式中，所述疫苗包括但不限于肌内、皮内、静脉内、经皮、局部或生物导弹给药。

43、如果所述疫苗的存在形式为多相乳液，可以直接滴鼻给药，更直接迅速地作用于鼻黏膜局部，诱导局部及系统免疫应答。

44、根据本发明的第六个方面，提出了所述疫苗在制备治疗呼吸道过敏性疾病的产品中的应用。

45、在本发明的一些实施方式中，所述呼吸道过敏性疾病包括过敏性鼻炎、过敏性哮喘、过敏性咳嗽中的任一种。所述呼吸道过敏性疾病主要由尘螨过敏原引发。

46、在本发明的一些实施方式中，所述疫苗为包括所述核酸分子的rna疫苗。

47、具体地，所述核酸分子为编码所述多肽的mrna，所述多肽的结构为p2-p1-pres-p3-p4。

48、具体地，所述多肽还包括信号肽，所述信号肽的氨基酸序列如seq id no:5所示。

49、具体地，seq id no:5为mhssallcclvlltgvra。

50、更具体地，所述多肽的结构为：信号肽-p2-p1-pres-p3-p4，对应的氨基酸序列如seq id no:6所示。

51、更具体地，seq id no:6为mhssallcclvlltgvra-nachymkcplvkgqqydiky-c-ggggs-rdqvdvkdcanheikkvl-c-ggggs-qvdvkdcanheikkvlvpgchgsepciihrgkpfql-c-ggggs-mggwsskprkgmgtnlsvpnplgffpdhqldpafgansnnpdwdfnpikdhwpaanqvgvgafgpgltpphggilgwspqaqgilttvstipppastnrqsgrqptpispplrdshpqamqwnstafhqalqdprvrglyfpaggsssgtvnpapniashissisartgdpvtnmenitsgflgpllvlqagfflltriltipqsldswwtslnflggspvclgqnsqsptsnhsptscppicpgyrwmclrrfiiflfilllclifllvlldyqgmlpvcplipgstttstgpcktcttpaqgnsmfpsccctkptdgnctcipipsswafakylwewasarfswlsllvpfvqwfvglsptvwlsaiwmmwywgpslysivspfipllpiffclwvyi-ggggs-ydikytwnvpkiapksenvv-c-ggggs-sidglevdvpgidpnachym。其中，ggggs为连接序列。

52、更具体地，编码所述多肽的mrna的核酸序列如seq id no:7所示。

53、更具体地，seq id no:7为cuagacaacauuuucagauuuuggugcaauuuucggaacauuccauguauauuuaauaucauagcuaccaccaccaccgcuaccaccaccaccgcuaccaccaccaccgcacauguaauggcaugcauuuggaucgauaccgggaacaucaacuucuaaaccaucgauugagcuaccaccaccaccgcuaccaccaccaccgcuaccaccaccaccaauauaaacccacagacaaaaaaagaucggcagcagaggaauaaacgggcuaacaaugcuauacaggcucggaccccaauaccacaucauccaaauugcgcucagccaaacggucggacucagaccaacaaaccacugaacaaacggaacuaacaggcucagccagcuaaaacgugcgcuugcccauucccacagauauuuugcaaaugcccagcugcucggaaucggaauacagguacaauuaccaucggucgguuugguacaacaacagcucggaaacaugcuauugcccugugccggugugguacagguuuuacacggaccgguacuggugguggugcuacccggaaucagcggacaaaccggcagcauacccugauaauccagcagcaccagcagaaagaucagacacagcagcagaauaaacagaaagaugauaaaacgacgcagacacauccaacgauaaccaggacaaauaggcggacaugaggucgggcuaugauugcuggucgggcucugugaauucugacccaggcaaaccggacuaccaccaagaaaauucaggcugguccaccaacuauccaggcucugcggaauugucagaaugcgggucagcagaaaaaagccugccugcagaaccagcagcggacccagaaaaccgcugguaauguuuuccauauugguaaccggaucaccgguacgugcgcuaaugcugcuaauauggcuugcaauauucggugccggauuaacggugccgcugcugcuaccgccugccggaaaauacagaccacgaacacgcggauccugcagugccugaugaaaugcggugcuauuccacugcauggccugcggauggcuaucacgcagcggagggcuaaucggugucggcugacgaccgcucugacgauuggugcuugccggaggcggaauggugcuaacgguggucagaauacccugugccugcggacuccaaccuaaaaugccaccaugcggaggggucagacccggaccaaaugcaccaacaccaaccugauuugcugcaggccaaugaucuuuaaucggguuaaaaucccaauccggguuauugcuauuugcaccaaaugccggauccagcugaugauccggaaaaaaacccagcggauucggaacgcucagauuggugcccauaccuuuacgcgguuugcugcuccaaccacccaugcuaccaccaccaccgcuaccaccaccaccgcuaccaccaccaccgcaauauuuaauaucauauuguuguccuuuaaccaaugggcauuucauguaauggcaugcauugcuaccaccaccaccgcuaccaccaccaccgcuaccaccaccaccgcacaaaacuuuuuugauuucaugauuggcacaaucuuugacaucgacuugaucacgggcccucaccccagucaggaggaccaggcaacagagcagugcugagcugugcau。

54、上述rna疫苗具有在细胞质迅速降解，半衰期短，可刺激th1型细胞反应等优点，适合用作过敏性疫苗。本发明选取的包含4个b细胞表位肽的多肽不引起过敏患者血清特异性ige反应，以该多肽构建的rna疫苗可诱导b细胞表位肽特异性igg抗体的产生，并有效降低尘螨过敏性患者外周血中的ige水平，增加外周血中调节性t细胞的比率，从而有效治疗过敏性疾病。

55、具体地，上述rna疫苗的构建方法，包括以下步骤：

56、s1：预测der p 2的4个b细胞表位肽；

57、s2：将所述4个b细胞表位肽连接至载体蛋白上，构建所述多肽；

58、s3：根据所述多肽的氨基酸序列推导出对应的cdna序列，并插入质粒中，转录形成mrna。

59、在本发明的一些实施方式中，步骤s1的具体方法包括以下步骤：采用abcpred和bepipred软件预测der p2(genbank：af276239.1)潜在的b细胞表位，在abcpred软件中输入der p2的全基因序列，分析出b细胞表位的起始位点，并计算得分情况；随后进一步利用bepipred软件分析b细胞表位位点，结合两个软件分析的情况初步预测潜在的b细胞表位。应用dnastar软件及线上蛋白二级结构分析系统对预测的b细胞表位的亲水性、柔韧性、表面可能性和二级结构进行分析，并对预测得到的b细胞表位进行who过敏原数据库进行分析比对，从而确定der p2的4个b细胞表位肽。

60、在本发明的一些实施方式中，步骤s3所述转录形成mrna后，还要在所述mrna的5’端添加帽子结构(cap)，3’端添加多聚腺苷酸尾，并对5’、3’非翻译区、编码区等进行修饰，以提高mrna的稳定性与翻译效率。

61、在本发明的一些实施方式中，步骤s3还包括将合成的mrna放入色谱柱中进行纯化，除去杂质。