一种光交联丝素蛋白止血粘合剂及其制备方法

1.本发明属于生物材料和生物医学应用领域，具体涉及一种光交联丝素蛋白止血粘合剂及其制备方法。


背景技术：

2.因意外伤害或临床手术操作导致的大量出血是当前世界人口死亡的主要原因之一。目前，临床上治疗组织出血的主要手段仍为手术缝合，通过缝合线、金属丝或闭合钉进行手术闭合。但是这种治疗手段操作复杂，耗时较长，对于操作者的水平要求较高，缝合处形成很高的应力集中，增加病患痛苦，而且多数患者有不同程度的线结反应，术后留下“蜈蚣”样瘢痕。此外，在心脏、肝脏之类的软组织修复中，传统的缝合材料易对组织造成二次损伤，某些薄壁组织（如肺、肝或肾等）就不宜使用缝合的方式进行修复，如动脉缺损之类较小的组织损伤也会因没有足够的空间而使得常规缝合难以实现，即使在可以缝合的组织中，可能也需要使用止血粘合生物材料以实现更好的密封。随着现代医学的快速发展，临床上对手术方法和辅助材料的要求越来越高，不仅要求最大限度的减轻患者痛苦，而且要求在恢复功能的同时，外观也能完美的恢复，这些需求使得组织粘合剂的研发受到广泛关注。
3.随着材料科学的发展，已经开发了多种用于组织粘合的粘合剂材料，当前已经开发出的组织粘合剂主要包含天然组织粘合剂和合成组织粘合剂。常见的天然组织粘合剂包括基于纤维蛋白、明胶、胶原蛋白、多糖、多肽等的粘合剂。这些粘合剂生物相容性好，但普遍存在力学性能和灵活性较差、粘附强度低（尤其在湿组织表面粘附力差）、止血速度慢、生产成本高等问题。常见的合成粘合剂包括氰基丙烯酸盐粘合剂和聚乙二醇粘合剂。目前临床使用最广泛的合成粘合剂是氰基丙烯酸盐粘合剂，其粘合强度高，但生物相容性和生物降解性较差，有毒的降解产物可能引起异物反应甚至坏死。此外，氰基丙烯酸盐粘合剂的高刚度会阻碍诸如肺，心脏和血管之类的弹性组织和软组织的生理运动，不利于组织再生和生物整合，因此这种粘合剂仅限于外部（如皮肤）损伤的修复。因此，开发出一种生物相容性好、体内湿润环境下粘合强度高的组织粘合剂显得尤为必要。
4.光交联水凝胶是指采用特定波长的光照，触发单一组分水凝胶前体溶液或复合水凝胶预聚物发生胶凝化而形成的固态水凝胶材料。光交联水凝胶的非物理接触方式能够有效提高粘合剂施加的时空可控性，实现对材料整体或局部性能的调控，减少因操作熟练度产生的影响，在组织工程和生物医学领域的止血粘合剂方面具有广阔的应用前景。丝素蛋白是来源于家蚕的天然蛋白质，具有良好的生物相容性、适宜的生物降解性等生物医学方面的性能，已经被fda批准可应用于医用设备。当前，已有专利报道光交联丝素蛋白水凝胶的制备。公开号为cn 114773549 a的中国发明专利“一种新型甲基丙烯酸酐改性丝素的制备方法”中，通过经丝素蛋白进行甲基丙烯酸缩水甘油酯改性，再用液氮低温处理、冷冻干燥，得到液氮-甲基丙烯酰化丝素蛋白，经过光交联制备丝素蛋白水凝胶。公开号为cn 114524953 a 的中国发明专利“一种丝素蛋白/透明质酸复合水凝胶、制备方法和应用”中，以丝素蛋白和透明质酸为原料，将丝素蛋白通过甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰，将透明质酸
通过甲基丙烯酸酐修饰，将修饰的产物混合溶于去离子水，利用紫外光驱动交联得到水凝胶。但上述的甲基丙烯酸酯化的丝素蛋白光交联水凝胶由于缺乏湿态粘附功能基团以及多重分子间相互作用，导致它们在湿态环境（水和血液等）下与生物体表面的粘合强度较低，机械韧性较差，不能适应湿态生理环境下组织界面的动态粘附等问题。
5.因此，本发明以甲基丙烯酸酯化的丝素蛋白为基质材料，加入多巴胺接枝的海藻酸、钙离子以及光引发剂，采用紫外光照射使混合溶液在1-60秒内快速交联聚合，在化学共价键交联和金属离子键动态交联存在下，得到机械韧性强、湿态环境下粘合强度高、成型粘合速度快、生物相容性好的丝素蛋白止血粘合剂。目前，在国内外有关的专利中，还未有相关的研究报道。


技术实现要素：

6.本发明目的在于针对现有技术不足，提供一种生物相容性好、体内湿态环境下粘合强度高、成型粘合速度快、机械韧性强的组织止血粘合剂。本发明克服了现有组织止血粘合剂在体内生理环境下成型速度慢、粘合强度低、生物相容性差、机械韧性差等方面的问题，制备的丝素蛋白止血粘合剂可用于几乎所有的创伤创面，具有粘合组织、覆盖创面、填补组织缺损和空隙、止血、密封等作用。
7.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种光交联丝素蛋白止血粘合剂的制备方法：以甲基丙烯酸酯化的丝素蛋白为基质，加入多巴胺修饰的海藻酸、二水硫酸钙以及光引发剂，室温避光搅拌均匀，在紫外光照射下混合溶液60秒内快速交联聚合，在化学共价键交联和金属离子键动态交联存在下，得到机械性能强健、湿态生理环境下粘附性能高的丝素蛋白止血粘合剂。
8.进一步的，一种光交联丝素蛋白止血粘合剂的制备方法，具体包括如下步骤：（1）制备甲基丙烯酸酯化的丝素蛋白溶液：将去离子水加热至沸腾后，加入na2co3和蚕丝，对蚕丝进行脱胶处理；洗涤烘干后，将烘干的脱胶蚕丝用溴化锂溶液溶解，得到丝素蛋白溶液，随后加入甲基丙烯酸缩水甘油酯对丝素蛋白进行改性，然后用去离子水透析；透析后的溶液经离心过滤处理得到甲基丙烯酸酯化的丝素蛋白溶液；所述的丝素蛋白溶液的质量百分浓度在0.1 %
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50 %或浓度为0.01 mg/ml
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500 mg/ml之间。
9.（2）制备多巴胺修饰的海藻酸：将海藻酸钠充分溶解于去离子水中，随后加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺，活化羧基；活化结束后加入盐酸多巴胺反应过夜，反应过程中控制反应体系ph ≤ 5；所得溶液经透析，冷冻干燥处理后得到白色海绵状物质，用去离子水溶解得到多巴胺修饰的海藻酸溶液；所述的多巴胺修饰的海藻酸溶液的质量百分浓度在0.1 %
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50 %或浓度为0.01 mg/ml
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500 mg/ml之间。
10.（3）光交联丝素蛋白止血粘合剂：将步骤（2）制得的多巴胺修饰的海藻酸溶液、二水硫酸钙和光引发剂lap，室温避光下溶解于步骤（1）制得的甲基丙烯酸酯化的丝素蛋白溶液中，避光搅拌均匀，得到前体溶液；该前体溶液在紫外光照射下1分钟内快速交联聚合，得到机械性能强健、湿态生理环境下粘附性能高的丝素蛋白止血粘合剂。加入的多巴胺修饰的海藻酸与甲基丙烯酸酯化的丝素蛋白的质量比为100:1
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1:100。所用的紫外光照射的紫外光波长为200
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400纳米。
11.利用上述制备方法制得的光交联丝素蛋白止血粘合剂，可作为皮肤、脏器、血管、
神经、肌肉、粘膜、骨、关节、眼睛等组织的止血粘合材料，可以实现湿态环境下（包括水、pbs缓冲液、血液环境）的快速粘合，粘合时间为60秒以内；具有良好的生物相容性和强粘合力，可用于几乎所有的创伤创面，具有粘合组织、覆盖创面、填补组织缺损和空隙、止血、密封等作用。
12.本发明的显著优点在于：（1）本发明以具有优异生物相容性的丝素蛋白作为粘合剂的主要成分，制备甲基丙烯酸酯化的丝素蛋白，加入多巴胺修饰的海藻酸、二水硫酸钙以及光引发剂。在紫外光照射下甲基丙烯酸酯化的丝素蛋白形成化学共价键交联并诱导丝素蛋白分子的构象转变为β-sheet，海藻酸分子与金属钙离子之间形成动态的金属离子螯合作用，海藻酸接枝的多巴胺基团与金属钙离子之间的多酚-金属离子键，赋予了材料优异的机械韧性。与传统的甲基丙烯酸酯化丝素蛋白光交联水凝胶相比，本发明的机械韧性显著增强。而传统的甲基丙烯酸酯化丝素蛋白光交联水凝胶仅是依靠甲基丙烯酸酯化的丝素蛋白形成化学共价键交联，没有引入具有动态能量耗散机制的离子键等分子间相互作用，导致机械韧性较差。
13.（2）海藻酸接枝的多巴胺基团能够与潮湿的生物组织表面紧密结合，基于在化学共价键交联和金属离子键动态交联的协同作用，显著提高了止血粘合剂在湿态环境下与生物体表面的粘合强度，赋予了出色湿态黏附能力。本发明在湿态环境下（包括水、pbs缓冲液、血液环境）对组织的粘合强度为400 kpa以上。而传统的甲基丙烯酸酯化的丝素蛋白光交联水凝胶由于缺乏湿态粘附功能基团，在湿态环境（水和血液等）下与生物体表面的粘合强度较差（粘合强度为30 kpa以下），不能适应组织界面的动态粘附。因此，本发明更适合受损组织大量出血的湿润环境，具有良好的组织止血粘合潜力，可作为皮肤、脏器、血管、神经、肌肉、粘膜、骨、关节、眼睛等组织的止血粘合材料，（3）本发明中光触发的非入侵交联方式能够实现在紫外光照射下1-60秒内快速交联成型，其快速交联成型原理归因于甲基丙烯酸酯化丝素蛋白中甲基丙烯酸酯基团的快速可光交联反应、海藻酸与金属钙离子之间的快速金属离子螯合作用、多巴胺基团与金属钙离子之间的快速多酚-金属离子键以及丝素蛋白分子与多巴胺基团之间快速的静电相互作用。本发明有效避免了长时间紫外光照射造成的环境危害，提高止血粘合剂施加的时空可控性和人体组织的适应性。。
14.（4）本发明中的组织粘合剂可以根据患者需要对不同大小和形状的创口进行粘合，原位固化的特点为临床应用提供了便捷。
15.（5）本发明的原料均来自天然化合物，因此具有良好的生物相容性。
16.（6）本发明操作简单，易于批量化生产等优势，具有良好的产业化前景。
附图说明
17.图1光交联丝素蛋白止血粘合剂的水下成型粘合宏观效果图。
18.图2光交联丝素蛋白止血粘合剂对创伤心脏组织的止血效果图。
具体实施方式
19.为了验证设计的可行性，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明应用不仅限于此。
20.实施例1（1）将1 l去离子水加热至沸腾后，加入5.3 g碳酸钠，待其充分溶解。将40 g家蚕蚕丝放入其中，100 ℃脱胶处理30分钟。将煮过的蚕丝取出用去离子水充分洗涤，于60 ℃烘箱中烘干。将烘干的脱胶蚕丝加入到9.3m 的libr溶液中60 ℃下溶解1 h得到丝素蛋白溶液，随后在丝素蛋白溶液中加入12 ml甲基丙烯酸缩水甘油酯，60 ℃下反应3 h，反应过程全程避光。将反应后的溶液装入透析袋中，用去离子水透析7天，透析过程全程避光。透析后的溶液经过滤离心，浓缩后得到质量分数约为25 %的甲基丙烯酸酯化的丝素蛋白溶液。
21.（2）向圆底烧瓶中加入400mg海藻酸钠和50ml去离子水，磁力搅拌下充分溶解。随后加入383.4mg edc和230.18 mg nhs，活化羧基，调节反应溶液ph至5。加入189.62 mg盐酸多巴胺，搅拌过夜反应12h。反应结束后将所得溶液装入透析袋透析24 h。透析结束后将所得溶液于冷冻干燥得到白色海绵状物质，用去离子水溶解得到质量分数约为5%的多巴胺修饰的海藻酸溶液。
22.（3）在室温避光条件下，向5ml甲基丙烯酸酯化的丝素蛋白溶液中加入1ml多巴胺修饰的海藻酸溶液、0.1 ml浓度为0.75 m的二水硫酸钙溶液，待混匀后加入终浓度为0.03wt%的lap 引发剂，搅拌混匀获得粘合剂前体溶液。该粘合剂前体溶液在紫外光下（波长365纳米）光照5秒内迅速交联，得到粘合剂。
23.该粘合剂用于心脏等软组织的止血粘合，具有优异的湿态黏附效果。粘合剂在湿态环境（水）下的粘合力强度为650 kpa，韧性为80 kj/m3。图1是光交联丝素蛋白止血粘合剂的水下成型粘合宏观效果图。本发明能够在紫外光照射后实现快速交联。即便是在水下进行操作，该水凝胶仍旧表现出优异的交联速度和黏附效果，能够在水下牢固地黏附在玻璃基底表面，承受强力水流冲刷。图2是光交联丝素蛋白止血粘合剂对创伤心脏组织的止血效果图。本发明能够在跳动的心脏表面实现创伤组织的快速止血，能够耐受激烈的机械运动。而传统的甲基丙烯酸酯化的丝素蛋白光交联水凝胶（对比例1）由于缺乏湿态粘附功能基团，在水下与生物体表面的粘合强度较差，粘合力强度为28 kpa，韧性为4.5 kj/m3。
24.实施例2（1）将2 l去离子水加热至沸腾后，加入8.48 g碳酸钠，待其充分溶解。将20 g家蚕蚕丝放入其中，100 ℃脱胶处理30分钟。将煮过的蚕丝取出用去离子水充分洗涤，于50 ℃烘箱中烘干。将烘干的脱胶蚕丝加入到9.3m 的libr溶液中60 ℃下溶解3 h得到丝素蛋白溶液，随后在丝素蛋白溶液中加入6 ml甲基丙烯酸缩水甘油酯，60 ℃下反应3 h，反应过程全程避光。将反应后的溶液装入透析袋中，用去离子水透析7天，透析过程全程避光。透析后的溶液经过滤离心，浓缩后得到质量分数约为5 %的甲基丙烯酸酯化的丝素蛋白溶液。
25.（2）向圆底烧瓶中加入800 mg海藻酸钠和50 ml去离子水，磁力搅拌下充分溶解。随后加入750 mg edc和460 mg nhs，活化羧基，调节反应溶液ph至5。加入400 mg盐酸多巴胺，搅拌过夜反应12h。反应结束后将所得溶液装入透析袋透析24 h。透析结束后将所得溶液于冷冻干燥得到白色海绵状物质，用去离子水溶解得到质量分数约为15 %的多巴胺修饰的海藻酸溶液。
26.（3）在室温避光条件下，向10 ml甲基丙烯酸酯化的丝素蛋白溶液中加入7 ml多巴胺修饰的海藻酸溶液、0.3 ml浓度为0.75 m的二水硫酸钙溶液，待混匀后加入终浓度为0.02wt%的lap 引发剂，搅拌混匀获得粘合剂前体溶液。该粘合剂前体溶液在紫外光下（波
长400纳米）光照20秒内迅速交联，得到粘合剂。
27.该粘合剂用于胃、肠等软组织的密封粘合，具有优异的湿态黏附效果。粘合剂在湿态环境（水）下的粘合力强度为410 kpa，韧性为50 kj/m3。
28.实施例3（1）将10 l去离子水加热至沸腾后，加入50 g碳酸钠，待其充分溶解。将400 g家蚕蚕丝放入其中，100 ℃脱胶处理30分钟。将煮过的蚕丝取出用去离子水充分洗涤，于70 ℃烘箱中烘干。将烘干的脱胶蚕丝加入到9.3m 的libr溶液中60 ℃下溶解6 h得到丝素蛋白溶液，随后在丝素蛋白溶液中加入150 ml甲基丙烯酸缩水甘油酯，60 ℃下反应6 h，反应过程全程避光。将反应后的溶液装入透析袋中，用去离子水透析5天，透析过程全程避光。透析后的溶液经过滤离心，浓缩后得到质量分数约为50 %的甲基丙烯酸酯化的丝素蛋白溶液。
29.（2）向圆底烧瓶中加入2 g海藻酸钠和50 ml去离子水，磁力搅拌下充分溶解。随后加入1.5 g edc和1 g nhs，活化羧基，调节反应溶液ph至5。加入1.5 g盐酸多巴胺，搅拌过夜反应12h。反应结束后将所得溶液装入透析袋透析24 h。透析结束后将所得溶液于冷冻干燥得到白色海绵状物质，用去离子水溶解得到质量分数约为50 %的多巴胺修饰的海藻酸溶液。
30.（3）在室温避光条件下，向30 ml甲基丙烯酸酯化的丝素蛋白溶液中加入10 ml多巴胺修饰的海藻酸溶液、3 ml浓度为0.75 m的二水硫酸钙溶液，待混匀后加入终浓度为0.05wt%的lap 引发剂，搅拌混匀获得粘合剂前体溶液。该粘合剂前体溶液在紫外光下（波长250纳米）光照50秒内迅速交联，得到粘合剂。
31.该粘合剂用于皮肤、血管、肌肉、肝脏等软组织的止血粘合，具有优异的湿态黏附效果。粘合剂在湿态环境（水）下的粘合力强度为520 kpa，韧性为70 kj/m3。
32.对比例1（传统的甲基丙烯酸酯化丝素蛋白光交联水凝胶）（1）同实施例1步骤（1）；（2）在室温避光条件下，向5ml甲基丙烯酸酯化的丝素蛋白溶液中加入终浓度为0.03wt%的lap 引发剂，搅拌混匀获得前体溶液。该前体溶液在紫外光下（波长365纳米）光照交联，得到粘合剂。
33.对比例2（丝素蛋白未经甲基丙烯酸酯化）（1）将1 l去离子水加热至沸腾后，加入5.3 g碳酸钠，待其充分溶解。将40 g家蚕蚕丝放入其中，100 ℃脱胶处理30分钟。将煮过的蚕丝取出用去离子水充分洗涤，于60 ℃烘箱中烘干。将烘干的脱胶蚕丝加入到9.3m 的libr溶液中60 ℃下溶解1 h得到丝素蛋白溶液，将反应后的溶液装入透析袋中，用去离子水透析7天，透析过程全程避光。透析后的溶液经过滤离心，浓缩后得到质量分数约为25 %的丝素蛋白溶液。
34.（2）同实施例1步骤（2）；（3）除紫外光照交联时间不同，其余同实施例1步骤（3）。
35.对比例3（未加入多巴胺修饰的海藻酸）（1）同实施例1步骤（1）；（2）在室温避光条件下，向5ml甲基丙烯酸酯化的丝素蛋白溶液中加入0.1 ml浓度为0.75 m的二水硫酸钙溶液，待混匀后加入终浓度为0.03wt%的lap 引发剂，搅拌混匀获得粘合剂前体溶液。该粘合剂前体溶液在紫外光下（波长365纳米）光照交联，得到粘合剂。
36.对比例4（加入的海藻酸未经多巴胺修饰）（1）同实施例1步骤（1）；（2）向圆底烧瓶中加入海藻酸钠和去离子水，磁力搅拌下充分溶解，得到质量分数约为5%的海藻酸溶液；（3）在室温避光条件下，向5ml甲基丙烯酸酯化的丝素蛋白溶液中加入1ml的海藻酸溶液、0.1 ml浓度为0.75 m的二水硫酸钙溶液，待混匀后加入终浓度为0.03wt%的lap 引发剂，搅拌混匀获得粘合剂前体溶液。该粘合剂前体溶液在紫外光下（波长365纳米）光照交联，得到粘合剂。
37.上述采用单因素原则，制备的对比例2-4凝胶组（丝素蛋白未经甲基丙烯酸酯化、未加入多巴胺修饰的海藻酸、加入的海藻酸未经多巴胺修饰）的湿态粘附强度以及韧性模量均差于本发明实施例1。
38.以上所述仅为本发明的实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。