一种重组人源化胶原蛋白及其应用的制作方法

本发明属于重组蛋白，尤其涉及一种重组人源化胶原蛋白及其应用。

背景技术：

1、胶原蛋白是动物体内含量最丰富的蛋白质，约占体内所有蛋白质的30％。在表皮和真皮当中存在一层称为“微胶原层”的组织，里面含有大量的胶原蛋白，可以支撑表皮，防止皮肤塌陷，使皮肤紧致又光滑。补充iii型胶原蛋白是护肤的关键，因此，胶原蛋白可以广泛地应用在医药和化妆品等行业中。

2、然而，天然的胶原蛋白无法溶于水，难以被人体利用，且成分复杂，安全性较低。目前市面上常用的动物来源的胶原蛋白伴有传染的风险，同时人体使用后容易产生免疫排异。更为重要的是，动物源胶原蛋白通常通过酸、碱、酶解法处理得到，其生物学活性远远不及人体天然的胶原蛋白。人源的胶原蛋白可以从人胎盘原料中提取，但来源有限，且存在多方面的限制。

3、重组人源化胶原蛋白结构跟人体来源的胶原蛋白相似，经过设计和优化后，能够增加胶原蛋白的活性，降低免疫原性。

4、cn107714504a公开了一种同人源胶原蛋白组合物，该组合物包括如下重量比的组分：同人源胶原蛋白0.001～0.5％；植物调理剂0.2～20.0％；功能复配物0.05～10.0％；基质辅料69.5～99.7％；所述的同人源胶原蛋白结构氨基酸序列含有599个氨基酸，分子量为55.0kda。所述组合物具有保湿、透皮吸收、皮肤护理、抗炎低敏、滋养修复、抑菌方便的协同作用。虽然所述同人源胶原蛋白在护肤产品领域有着广阔的应用前景，但是由于同人源胶原蛋白分子量大稳定性差，生物学活性难以长期保持，从而导致其护肤效果不持久。

5、因此，如何提供一种溶解性好、免疫原性低、容易获取、生物活性高的人源iii型胶原蛋白及其制备方法，已成为亟待解决的问题。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种重组人源化胶原蛋白及其应用，所述重组人源化胶原蛋白具有良好的溶解性、稳定性与生物活性，生物粘附性高，具备促进细胞愈合能力与增殖能力，免疫原性低，具有实际应用的价值。

2、为达此目的，本发明采用如下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种重组人源化胶原蛋白，所述重组人源化胶原蛋白包括前导肽和至少一个基本重复单元；

4、所述基本重复单元包括seq id no.1所示的氨基酸序列。

5、其中，基本重复单元的数量例如可以是1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

6、seq id no.1：gpigppgprgnrgergsegspghpgqpgppgppgapgpc。

7、本发明中，通过添加人源前导肽，降低了重组胶原蛋白的免疫原性；选用ⅲ型胶原蛋白中具有晶体解析结构的片段作为基本重复单元，增加了重组胶原蛋白的稳定性。所述重组人源化胶原蛋白可通过蛋白表达技术进行体外表达，生产成本较低且产物成分单一，安全性更高；具有良好的可溶性及粘附性，生物活性好，在药品及化妆品等相关领域中具有广阔的应用前景。

8、本发明中，所述重组人源化胶原蛋白为单链结构，呈可溶性表达。

9、优选地，所述前导肽包括seq id no.2所示的氨基酸序列。

10、seq id no.2：mescptgpqnyspqydsydvksgvavg。

11、优选地，所述基本重复单元的数量为3～6个，例如可以是3个、4个、5个或6个。

12、本发明中，通过将基本重复单元的数量控制在3～6个的范围内，可以使重组蛋白兼具良好的稳定性及可溶性；若基本重复单元的数量较少，则重组蛋白的稳定性较差；若基本重复单元的数量过多，则会降低重组蛋白的可溶性。

13、优选地，所述重组人源化胶原蛋白包括seq id no.3所示的氨基酸序列。

14、seq id no.3：

15、mescptgpqnyspqydsydvksgvavggpigppgprgnrgergsegspghpgqpgppgppgapgpcgpigppgprgnrgergsegspghpgqpgppgppgapgpcgpigppgprgnrgergsegspghpgqpgppgppgapgpcgpigppgprgnrgergsegspghpgqpgppgppgapgpchhhhhh。

16、第二方面，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述的重组人源化胶原蛋白。

17、优选地，所述核酸分子包括seq id no.4所示的核苷酸序列。

18、seq id no.4：

19、atggaatcttgcccgaccggtccgcagaactactctccgcagtacgactcttacgacgttaaatctggtgttgctgttggtggtccgatcggtccgccgggtccgcgtggtaaccgtggtgaacgtggttctgaaggttctccgggtcacccgggtcagccgggtccgccgggtccgccgggtgctccgggtccgtgcggtccgatcggtccgccgggtccgcgtggtaaccgtggtgaacgtggttctgaaggttctccgggtcacccgggtcagccgggtccgccgggtccgccgggtgctccgggtccgtgcggtccgatcggtccgccgggtccgcgtggtaaccgtggtgaacgtggttctgaaggttctccgggtcacccgggtcagccgggtccgccgggtccgccgggtgctccgggtccgtgcggtccgatcggtccgccgggtccgcgtggtaaccgtggtgaacgtggttctgaaggttctccgggtcacccgggtcagccgggtccgccgggtccgccgggtgctccgggtccgtgccaccatcatcaccaccattaa。

20、本发明中，编码所述的重组人源化胶原蛋白的核酸分子序列根据宿主的密码子偏好性进行了密码子优化，显著提高了其在大肠杆菌中的表达效率。

21、本发明中，在所述核酸分子序列中引入了ndeⅰ和xhoⅰ酶切位点，用于与表达载体进行连接。

22、第三方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体含有至少一个拷贝的第二方面所述的核酸分子。

23、第四方面，本发明提供了一种重组细胞，所述重组细胞表达第一方面所述的重组人源化胶原蛋白。

24、优选地，所述重组细胞的基因组中整合有第二方面所述的核酸分子。

25、优选地，所述重组细胞中含有第三方面所述的表达载体。

26、第五方面，本发明提供一种第一方面所述的重组人源化胶原蛋白的制备方法，所述制备方法包括：

27、构建表达载体，将所述表达载体转入受体细胞中，筛选；

28、培养筛选得到的工程菌株，诱导表达并进行纯化，得到所述的重组人源化胶原蛋白。

29、优选地，所述受体细胞包括大肠杆菌表达菌株。

30、优选地，所述诱导表达的方法包括iptg诱导。

31、优选地，所述纯化前还包括破碎菌体的步骤。

32、优选地，所述纯化的方法包括镍离子柱亲和层析。

33、作为优选技术方案，本发明所述重组人源化胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：

34、(1)将编码所述重组人源化胶原蛋白的核酸分子连入质粒载体中，构建表达载体，将所述表达载体转入大肠杆菌表达菌株中，筛选，得到大肠杆菌基因工程菌株；

35、(2)发酵培养所述大肠杆菌基因工程菌株，用iptg诱导蛋白表达后，离心收集菌体；

36、(3)对收集得到的菌体进行超声破碎，离心收集上清液；

37、(4)对上清液进行镍离子柱亲和层析纯化，得到所述重组人源化胶原蛋白。

38、第六方面，本发明提供了第一方面所述的重组人源化胶原蛋白在制备化妆品或皮肤损伤治疗药物中的应用。

39、相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：

40、本发明在重组人源化胶原蛋白中引入基本重复单元，提高了胶原蛋白的可溶性，并增加了重组蛋白的稳定性；通过添加人源的前导肽，降低了蛋白的免疫原性，增加了相关产品的安全性；所述重组人源化胶原蛋白通过蛋白表达系统在体外合成，产量高，成本低，反应条件温和，减少了化学物质对重组蛋白活性的影响。胶原是细胞外基质的主要成分。重组人源化胶原蛋白的主要生物学功能是为细胞提供支架和良好的微环境，如促进细胞粘附、增殖生长、迁移等。因此，可通过评价细胞-胶原蛋白相互作用来评价重组胶原蛋白的生物学功能。本发明重组人源化胶原蛋白的细胞粘附活性优于天然人胶原蛋白，具有良好的细胞迁移活性与促进细胞增殖生长能力，同时具备热稳定特质。生物活性更好，粘附性更强，良好的粘附性可提高其与皮肤的紧密贴合，在创面修复领域具有重要的应用前景。重组人源化胶原蛋白制备方法技术成熟，容易操作，促进了相关产品的推广与使用。