一种抗CD22纳米抗体及其应用的制作方法

本发明属于生物医药，涉及一种抗cd22纳米抗体及其应用。

背景技术：

1、b细胞急性淋巴细胞白血病(b cell acute lymphoblastic leukemia，b-all)是一种侵袭性血液系统恶性肿瘤，其特征是cd19+b细胞前体的克隆扩增。b-all是儿童中最常见的恶性肿瘤之一，在成人中虽然较为少见，但是却有不良的预后。尽管超过90％的患者在一线治疗后得到完全缓解，但难治/复发(r/r)b-all患者的预后较差。

2、过继转移经过改造以表达靶向肿瘤细胞表面相关抗原的人工嵌合抗原受体t细胞(chimeric antigen receptort cells，car-t)是一种革命性的癌症免疫细胞疗法。目前，cd19 car-t疗法是b-all的理想细胞疗法之一，cd19在恶性细胞上均匀表达，而其脱靶表达仅限于正常b细胞，并且cd19 car-t导致的b细胞发育不全在临床上通过使用γ-免疫球蛋白很容易得到控制。cd19 car-t彻底改变了r/r b-all的治疗，完全缓解率达到80％～90％；然而，40％～60％接受cd19靶向免疫疗法治疗的患者在1年后仍会复发。复发类型主要分为两种：一种仍为cd19+的复发，通常是t细胞功能差或car-t细胞持续时间短；另外一种为cd19的复发，其疾病复发时伴随着细胞表面cd19表达的丢失，代表了一种新的“干细胞起源相关”的肿瘤逃逸机制。

3、car-t治疗b-all的另外一个有希望的靶点是cd22。cd22是一种唾液酸结合粘附分子，其表达主要局限于b细胞，并在大多数b细胞恶性肿瘤中高表达。cd22靶向免疫疗法已在多项研究中得到开发和测试，如cn111320703a公开了一种靶向cd22的嵌合抗原受体及其应用，所述嵌合抗原受体序列选自如下两种结构中的一种，第一种结构：cd22抗原结合结构域与t细胞受体(tcr)的恒定结构域；第二种结构：顺序串联的跨膜蛋白信号肽、cd22抗原结合结构域、cd8蛋白分子的铰链区、跨膜区、4-1bb共刺激结构域与cd3ζ胞内信号传导结构域；此外，在一项针对cd19 car-t治疗后出现疾病进展的儿童和年轻成人b-all患者的研究中，cd22 car-t可诱导73％的完全缓解率，其对cd19+和cd19-b-all的有效性相同。但是复发也很常见，一部分患者的复发与cd22表达下调相关。因此，r/r b-all在临床上仍然具有挑战性。

4、综合上述，针对r/r b-all开发高效的car-t疗法，对于b-all治疗领域具有重要意义。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种抗cd22纳米抗体及其应用，所述抗cd22纳米抗体具备高亲和力和特异性，能够高效靶向cd22，以抗cd22抗体为抗原结合结构域构建的car-t细胞能够高效靶向肿瘤细胞cd22，从而介导免疫细胞杀伤肿瘤细胞。

2、为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种抗cd22抗体，所述抗cd22抗体包括重链可变区，所述重链可变区的cdr1的氨基酸序列包括seq id no.1或seq id no.2所示的序列，所述重链可变区的cdr2的氨基酸序列包括seq id no.3或seq id no.4所示的序列，所述重链可变区的cdr3的氨基酸序列包括seq id no.5或seq id no.6所示的序列。

4、本发明筛选抗cd22抗体，所述抗cd22抗体仅包括重链可变区具备高亲和力和特异性，能够高效靶向cd22抗原，结构简单，易于制备，在制备以cd22为靶点的药物领域具有重要应用价值。

5、seq id no.1：gdthssyc。

6、seq id no.2：gytnsrry。

7、seq id no.3：vdsdgkq。

8、seq id no.4：iytgdgdsrt。

9、seq id no.5：aaapwcyreaedfti。

10、seq id no.6：aadvwyhgdwndpklypy。

11、优选地，所述重链可变区的cdr1的氨基酸序列包括seq id no.1所示的序列，cdr2的氨基酸序列包括seq id no.3所示的序列，cdr3的氨基酸序列包括seq id no.5所示的序列。

12、优选地，所述重链可变区的cdr1的氨基酸序列包括seq id no.2所示的序列，cdr2的氨基酸序列包括seq id no.4所示的序列，cdr3的氨基酸序列包括seq id no.6所示的序列。

13、优选地，所述重链可变区还包括框架区fr1-fr4。

14、优选地，所述fr1的氨基酸序列包括seq id no.7或seq id no.8所示的序列。

15、优选地，所述fr2的氨基酸序列包括seq id no.9或seq id no.10所示的序列。

16、优选地，所述fr3的氨基酸序列包括seq id no.11或seq id no.12所示的序列。

17、优选地，所述fr4的氨基酸序列包括seq id no.13所示的序列。

18、优选地，所述重链可变区的氨基酸序列包括seq id no.14或seq id no.15所示的序列。

19、seq id no.7：evqlvesggdsvqpggslrlscavs。

20、seq id no.8：evqlvesggasvqaggsltlscaas。

21、seq id no.9：lawfrqapgkeregvaf。

22、seq id no.10：mawfrqtpgkeregvay。

23、seq id no.11：

24、ihadsvkgrftgsrdntkntlflqmdslqledtamyyc。

25、seq id no.12：

26、yyadsvkgrftisrdnakgtvnlqmnslqpgdsamyyc。

27、seq id no.13：wgqgtqvtvss。

28、seq id no.14：

29、evqlvesggdsvqpggslrlscavsgdthssyclawfrqapgkeregvafvdsdgkqihadsvkgrftgsrdntkntlflqmdslqledtamyycaaapwcyreaedftiwgqgtqvtvss。

30、seq id no.15：

31、evqlvesggasvqaggsltlscaasgytnsrrymawfrqtpgkeregvayiytgdgdsrtyyadsvkgrftisrdnakgtvnlqmnslqpgdsamyycaadvwyhgdwndpklypywgqgtqvtvss。

32、本发明将所述抗cd22抗体的编码基因插入表达载体，得到重组表达载体，将所述重组表达载体导入细胞并进行培养，进行分离纯化，得到所述抗cd22抗体。

33、第二方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子包括第一方面所述的抗cd22抗体的编码基因。

34、优选地，所述核酸分子包括seq id no.16或seq id no.17所示的序列。

35、seq id no.16：

36、gaagtgcagctggtggaatctggcggcgatagcgtgcagcctggcggcagcctgagactgagctgtgccgtgagcggcgatacccatagcagctattgtctggcctggtttagacaggcccctggcaaagaaagagaaggcgtggcctttgtggattccgatggaaaacagattcatgccgatagcgtgaaaggccggtttaccggctccagagataataccaaaaataccctgtttctgcagatggatagcctgcagctggaagataccgccatgtattattgtgccgccgccccttggtgttatagagaagccgaagattttaccatttggggccagggcacccaggtgaccgtgagcagc。

37、seq id no.17：

38、gaggtgcagctggtggagagcggcggcgccagcgtgcaggccggcggcagcctgaccctgagctgtgctgcctctggatacacaaattctagaagatatatggcctggtttagacagaccccaggaaaagagagagaaggcgtggcttatatctatacaggcgatggagattctagaacatattatgccgatagcgtgaagggcagattcacaattagcagagacaacgccaagggcaccgtgaacctgcagatgaacagcctgcagcccggcgacagcgccatgtactactgcgccgccgacgtgtggtaccacggcgactggaacgacccaaagctgtacccctactgggggcagggcacccaggtgaccgtgagcagc。

39、本发明所述的核酸分子能够准确编码第一方面所述的抗cd22抗体。

40、第三方面，本发明提供一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域和信号转导结构域，所述抗原结合结构域第一方面所述的抗cd22抗体。

41、本发明中，利用所述抗cd22抗体构建嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体能够高效靶向cd22。

42、优选地，所述信号肽包括cd8α信号肽。

43、优选地，所述抗原结合结构域还同时包括抗cd19抗体。

44、优选地，所述抗原结合结构域包括抗cd19抗体和抗cd22抗体依次串联构成的抗原结合结构域或抗cd22抗体和抗cd19抗体依次串联构成的抗原结合结构域。

45、优选地，所述铰链区包括cd8α铰链区；

46、优选地，所述跨膜区包括cd8α跨膜区、cd28跨膜区或dap10跨膜区中的任意一种或至少两种的组合；

47、优选地，所述信号转导结构域包括免疫受体酪氨酸活化基序；

48、优选地，所述信号转导结构域还包括共刺激分子，所述共刺激分子包括4-1bb、cd28胞内区、ox40、icos或dap10胞内区中的任意一种或至少两种的组合

49、优选地，所述嵌合抗原受体还包括cd3ε或cd3γ。

50、优选地，所述信号肽的氨基酸序列包括seq id no.18所示的序列。

51、优选地，所述cd8α铰链区和跨膜区的氨基酸序列包括seq id no.19所示的序列。

52、优选地，所述免疫受体酪氨酸活化基序的氨基酸序列包括seq id no.20所示的序列。

53、优选地，所述cd3ε的氨基酸序列包括seq id no.21所示的序列。

54、优选地，所述cd3γ的氨基酸序列包括seq id no.22所示的序列。

55、优选地，优选地，所述嵌合抗原受体包括抗cd19抗体和cd3ε融合得到的第一条肽链及抗cd22抗体和cd3γ融合得到的第二条肽链，或所述嵌合抗原受体包括抗cd22抗体和cd3ε融合得到的第一条肽链及抗cd19抗体和cd3γ融合得到的第二条肽链。

56、第四方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包括第三方面所述的嵌合抗原受体的编码基因。

57、优选地，所述表达载体为含有第三方面所述的嵌合抗原受体的编码基因的慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种，优选为慢病毒载体。

58、第五方面，本发明提供一种重组慢病毒，所述重组慢病毒含有第四方面所述的表达载体。

59、本发明中，所述重组慢病毒由转染第四方面所述的表达载体和辅助质粒的哺乳细胞制备得到。

60、第六方面，本发明提供一种嵌合抗原受体免疫细胞，所述嵌合抗原受体免疫细胞表达第三方面所述的嵌合抗原受体。

61、本发明利用所述抗cd22抗体制备嵌合抗原受体，并进一步制备嵌合抗原受体免疫细胞，所述嵌合抗原受体免疫细胞能够特异性识别cd22和/或cd19阳性肿瘤细胞，并进行高效杀伤，同时还能释放多种细胞因子包括il-2、tnf-α和ifn-γ因子等发挥细胞杀伤作用。

62、优选地，所述嵌合抗原受体免疫细胞包括第四方面所述的表达载体和/或第五方面所述的重组慢病毒。

63、优选地，所述免疫细胞包括t淋巴细胞、b淋巴细胞、nk细胞、肥大细胞或巨噬细胞中的任意一种或至少两种的组合。

64、第七方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第六方面所述的嵌合抗原受体免疫细胞。

65、优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。

66、第八方面，本发明提供第一方面所述的抗cd22抗体、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的嵌合抗原受体、第四方面所述的表达载体、第五方面所述的重组慢病毒、第六方面所述的嵌合抗原受体免疫细胞或第七方面所述的药物组合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。

67、优选地，所述肿瘤包括b细胞急性淋巴细胞白血病。

68、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

69、(1)本发明的抗cd22抗体仅包括重链可变区具备高亲和力和特异性，能够高效靶向cd22抗原，且结构简单，易于制备；

70、(2)本发明中，利用所述抗cd22抗体构建嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体能够高效靶向cd22，此外，抗原结合结构域可同时采用抗cd22抗体和抗cd19抗体，从而制备能够同时靶向cd22和cd19的嵌合抗原受体；

71、(3)本发明的嵌合抗原受体细胞能够特异性识别cd22和/或cd19阳性肿瘤细胞，并进行高效杀伤，同时还能释放多种细胞因子包括il-2、tnf-α和ifn-γ因子等发挥细胞杀伤作用。