一种两步法等温核酸扩增检测微流控装置的制作方法

1.本发明涉及体外诊断技术领域，尤其涉及一种可用于基层医疗机构或患者床旁等现场即时检测场景的两步法等温核酸扩增检测微流控芯片及其检测装置。


背景技术：

2.体外诊断(in vitro diagnosis，ivd)技术，是指在人体之外，通过对机体包括血液、体液及组织等样本进行检测而获取相关的临床诊断信息，从而帮助判断疾病或机体功能的产品和服务。现场快速检测 (point-of-care testing, poct)技术是体外诊断技术中的一种，是指在采样现场进行的、利用便携式分析仪器及配套试剂快速得到检测结果的一种检测方式，具有快速简便、现场分析等特点，能减少样品转送流程，缩短报告时间。
3.核酸扩增检测技术是利用不同扩增方法对核酸分子进行多次复制，通过检测扩增产物来实现高灵敏度、高特异性检测的一种分子检测技术。pcr作为核酸扩增技术的典型代表，具有灵敏度高、特异性高、技术成熟和应用广泛等特点，但因其需要包括变性、退火、延伸三个反应阶段的复杂热循环过程，往往需要依靠精密仪器在医院或医学检验中心进行，不利于在基层医疗机构推广应用。
4.等温扩增技术是近年发展起来的一类核酸扩增技术，与pcr技术相比，其只需保持恒温条件即可完成扩增反应，因此系统复杂度及操作繁琐性显著降低，特别适合在基层医疗机构或者患者床旁等现场即时诊断环境下使用。
5.当模板dna浓度较低时，用一次扩增反应难以得到满意的结果，为了提高核酸扩增检测准确度，有效检测出低浓度的样本，研发两步法核酸扩增检测芯片及其检测装置具有重要的现实意义，更重要的是，等温核酸扩增技术可使得装置扩增部分结构设计简单，成本较低，结合气密性良好的微流控芯片可以实现低成本高灵敏度的poct核酸扩增检测产品。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种低成本的、高灵敏度，且适用于现场即时诊断场景的两步法poct微流控核酸扩增检测芯片及其检测装置，以解决现有技术中存在的核酸扩增检测技术依赖实验室进行、仪器依赖固定电源，且单次核酸扩增无法有效检出低浓度样本的技术问题。
7.本发明采用的技术方案为一种两步法等温核酸扩增检测微流控装置，包括两步法微流控芯片和等温检测配套装置；所述两步法微流控芯片由等温检测配套装置夹持，并实现核酸扩增检测。
8.所述等温检测配套装置包括顺次连接的用户控制面板、芯片固定区和集成控制区；两步法微流控芯片由芯片固定区夹持固定，集成控制区用以驱动控制两步法微流控芯片中的试剂与缓冲液，集成控制区由用户控制面板控制。
9.所述两步法微流控芯片由上到下依次包括盖板、流体层、试纸条层和底板；所述盖板、流体层、试纸条层和底板连接后形成气密封闭结构。该气密封闭结构中，所述盖板和流
体层上均设有第一扩增腔、气源腔、第一缓冲液腔、第二缓冲液腔和第二扩增腔；流体层上设有曲折流道和气源流道；流体层中，气源腔通过气源流道与第一扩增腔连接，第一扩增腔与第一缓冲液腔之间，第一扩增腔与第二扩增腔之间，以及第二扩增腔与第二缓冲液腔之间均通过曲折流道连接；第二扩增腔下部对应的试纸条层上设有试纸条腔，所述试纸条腔中放置有试纸条；所述两步法微流控芯片的两步是，第一步由第一扩增腔与第一缓冲液腔之间进行的核酸预扩增，第二步由第二扩增腔与第二缓冲液腔之间的核酸扩增；核酸预扩增为核酸扩增提供模板，核酸扩增基于核酸预扩增的模板再次进行扩增，以实现核酸更高精度检测。
10.进一步地，所述盖板为两步法微流控芯片的第一层结构，所述流体层为两步法微流控芯片的第二层结构；第一扩增腔、气源腔、第一缓冲液腔、第二缓冲液腔和第二扩增腔为五个软膜结构，其中气源腔为驱动第一扩增腔提供动力；气源流道为推动第一扩增腔中的试剂提供流道；所述试纸条层为两步法微流控芯片的第三层结构，用于两步法微流控芯片的结果检测显示；所述底板为两步法微流控芯片的第四层结构，用于对两步法微流控芯片提供围护与气密封闭。
11.进一步地，所述第一缓冲液腔和第二缓冲液腔中预存有扩增反应所需的缓冲液；所述第一扩增腔、第二扩增腔为扩增反应发生的场所，能够同时容纳试剂、缓冲液或者试剂与缓冲液的混合液体；所述试剂为采集的核酸样本液，试剂于第一扩增腔中被加入；试纸条的结果由人眼识别判读或智能手机自动判读。
12.进一步地，所述用户控制面板包括第一按键和第二按键，第一按键和第二按键上设有凸起和震动马达，通过凸起控制气源腔的气源驱动力，以及第一缓冲液腔、第二缓冲液腔中缓冲液流动驱动力；通过震动马达对缓冲液与试剂的混合进行震动，以保证缓冲液与试剂的充分混合。
13.进一步地，所述的震动马达通过导杆与第二触控开关连接，所述导杆上套设有弹簧，弹簧用以控制震动马达的复位；通过第二触控开关对震动马达进行通电或断电控制。
14.进一步地，所述的芯片固定区包括芯片固定区前面板、芯片限位侧板、第一触控开关、金属弹片、第一加热模块、第二加热模块、芯片固定区后面板和芯片滑槽。芯片滑槽设置于两步法微流控芯片的底部，芯片固定区前面板与芯片固定区后面板组成两步法微流控芯片的前后围护结构，两步法微流控芯片被前后围护结构夹持，芯片限位侧板设置于前后围护结构的侧部；第一触控开关设置于芯片限位侧板上，第一加热模块和第二加热模块设置于芯片固定区后面板上，第一触控开关均与第一加热模块和第二加热模块连接，通过第一触控开关对第一加热模块和第二加热模块进行通电、断电控制，第一加热模块正对第一扩增腔，第二加热模块正对第二扩增腔；金属弹片设置于芯片限位侧板上，两步法微流控芯片沿芯片滑槽进入等温检测配套装置的芯片固定区中，由金属弹片对两步法微流控芯片进行压紧固定。
15.进一步地，所述试纸条通过气尾腔连接件与气尾腔连接，气尾腔用以吸收气密封闭结构中的气体，气尾腔连接件用以对气尾腔与两步法微流控芯片的连接处进行气密封闭。
16.进一步地，所述两步法微流控芯片由聚甲基丙烯酸甲酯pmma、聚碳脂酸或其他具有生物安全性的硬质材料制成；盖板、流体层、试纸条层和底板之间的键合方法是超声键
合、热压键合、溶剂键合、胶膜粘接中的一种或多种。
17.进一步地，所述试纸条腔宽度根据试纸条的宽度尺寸范围进行渐变，在距第二扩增腔一段距离时开始收窄；通过控制试纸条与试纸条腔之间的摩擦力大小，实现试纸条初始位置与检测位置的区分确认。
18.进一步地，根据等温检测配套装置的指示灯提示，操作所述等温检测配套装置上的按键，从而驱动两步法微流控芯片中的试剂进行核酸扩增，核酸扩增的结果由试纸条上的ct线显色程度指示。所述智能手机中安装有上位机软件，智能手机与上位机通过无线交互连接；上位机软件显示试纸条上的ct线显色程度指示，并调用图像算法对试纸条的核酸扩增结果进行读取识别。
19.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1、本发明设计了一种基于两步法实现核酸扩增检测的微流控芯片及检测装置，能够使用等温扩增技术对低浓度的样本进行两次扩增，以较低成本实现低浓度核酸的快速准确检出，整套装置成本较低，可使用电池供电，芯片操作简单且即用即弃，无气溶胶污染，尤其适合基层医疗机构或患者床旁等检测环境。
20.2、本发明的微流控芯片及检测装置操作简单，仅需将试剂注入芯片进样孔后，根据指示灯提示按下第一与第二按键，等待两次扩增结束后人工或自动判读结果即可；通过气密性的两步法微流控芯片对等温核酸扩增进行驱动控制，避免了外接污染。
21.3、本发明的微流控芯片及检测装置通过紧凑优化的结构设计，极大的压缩了装置尺寸，实现了手持式设计；同时，根据不同的场景或精度需求，将智能手机移除或加入检测装置，在确保检测效果的同时，显著降低了仪器成本，提高了仪器使用灵活性。所述两步法微流控芯片成本较低、加工复杂度低，便于大规模生产。
附图说明
22.图1为两步法等温核酸扩增检测微流控装置的结果自动判读方式下的整体结构示意图。
23.图2为两步法等温核酸扩增检测微流控装置的结果人工判读方式下的整体结构示意图。
24.图3为两步法微流控芯片的各层结构。
25.图4为两步法等温核酸扩增检测微流控装置的立体结构示意图。
26.图5为等温检测配套装置用户控制面板第一按键结构示意图。
27.图6为等温检测配套装置用户控制面板第二按键结构示意图。
28.图中：1、等温检测配套装置，2、两步法微流控芯片，3、智能手机，11、用户控制面板，12、芯片固定区，13、集成控制区，111、用户控制面板前面板，112、指示灯，113、第一按键，114、第二按键，115、弹簧，116、震动马达，117、导杆，118、第二触控开关，121、芯片固定区前面板，122、芯片限位侧板，123、第一触控开关，124、金属弹片，125、第一加热模块，126、第二加热模块，127、芯片固定区后面板，128、芯片滑槽，131、电池仓，132、背光源，133、智能手机固定架，134、主控制单元，21、盖板，22、流体层，23、试纸条层，24、底板，25、进样孔，26、胶体金纸条，27、气尾腔连接件，28、气尾腔，29、密封塞，211、第一扩增腔，212、气源腔，213、第一缓冲液腔，214、第二缓冲液腔，215、第二扩增腔，221、曲折流道，222、气源流道，231、试
纸条腔，116a、第一震动马达，116b、第二震动马达，116c、第三震动马达，1131、第一凸起，1132、第二凸起，1141、第三凸起。
具体实施方式
29.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
30.除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本发明的范围。
31.同时，应当明白，为了便于描述，附图中所示出的各个部分的尺寸并不是按照实际 的比例关系绘制的。
32.对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为授权说明书的一部分。
33.在这里示出和讨论的所有示例中，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制。因此，示例性实施例的其它示例可以具有不同的值。
34.应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步讨论。
35.本发明设计了一种两步法等温核酸扩增检测微流控装置，第一方面，提供一种两步法核酸扩增检测微流控芯片，包括核酸扩增区域和结果指示区域，核酸扩增区域是试剂混合、核酸扩增发生的场所，其上还包括两个预存缓冲液的液体腔室，两个用于扩增的腔室和一个用于试剂驱动的空气腔室；结果指示区域包括一胶体金纸条，吸取试剂后可通过ct线显色程度指示核酸扩增结果。第二方面，提供一种检测装置，包括用户操作区、芯片固定区和集成控制区，加样后的微流控芯片可推入检测装置的芯片固定区中，用户可在检测装置的操作区通过指示灯获取扩增进度，并根据提示按下相应按键，完成样品驱动。本发明能够脱离实验室检测环境、全封闭无污染且可由电池供电。
36.如图1-6所示，本发明采用的技术方案为一种两步法等温扩增检测微流控芯片，包括两步法微流控芯片2和等温检测配套装置1；所述两步法微流控芯片2的两步法是第一步核酸预扩增和第二步核酸扩增，第一步核酸预扩增为第二步核酸扩增提供模板，第二步核酸扩增基于第一步核酸预扩增的模板再次进行扩增，以实现核酸更高精度检测；两步法核酸扩增的过程中，通过等温检测配套装置1控制试剂于两步法微流控芯片2的核酸扩增区域（即两步法微流控芯片2中的腔体）处进行加热、扩增，进而混合实现核酸扩增检测；核酸扩增检测结果指示由设置于结果指示区域的试纸条实现，试纸条的结果由人眼识别判读或通过智能手机3自动判读。
37.进一步地，所述两步法微流控芯片2由上到下依次包括盖板21、流体层22、试纸条层23和底板24；所述盖板21、流体层22、试纸条层23和底板24连接后形成气密封闭结构。所述盖板21和流体层22上均设有第一扩增腔211、气源腔212、第一缓冲液腔213、第二缓冲液腔214和第二扩增腔215；流体层22上设有曲折流道221和气源流道222；流体层22中，气源腔
212通过气源流道222与第一扩增腔211连接，第一扩增腔211与第一缓冲液腔213之间，第一扩增腔211与第二扩增腔215之间，以及第二扩增腔215与第二缓冲液腔214之间均通过曲折流道221连接；第二扩增腔215下部对应的试纸条层23上设有试纸条腔231。
38.进一步地，所述盖板21为两步法微流控芯片2的第一层结构用以实现预存扩增反应；流体层22为盖板21提供流道；所述的试纸条层23为试纸条提供单层储存腔室，用于实现扩增反应后的试纸条层析；所述底板24将盖板21、流体层22和试纸条层23进行气密封闭。
39.进一步地，所述的两步法微流控芯片2角部设有与第一扩增腔211对应的凹槽，该凹槽内设有进样孔25，进样孔25与第一扩增腔211连接。所述进样孔25侧部设有密封塞29。
40.进一步地，所述试纸条腔231中放置有试纸条，所述试纸条为胶体金纸条26。
41.进一步地，所述试纸条通过气尾腔连接件27与气尾腔28连接。
42.进一步地，所述第一扩增腔211、第二扩增腔215扩增反应发生的场所能够同时容纳试剂与缓冲液。所述第一缓冲液腔213和第二缓冲液腔214中预存有扩增反应所需的缓冲液。
43.进一步地，所述盖板21、流体层22、试纸条层23和底板24均为硬材料制成并经激光切割后成型，再经键合形成一完整结构，工艺简单，加工过程简短；所述盖板21为两步法微流控芯片2的第一层结构，第一扩增腔211、气源腔212、第一缓冲液腔213、第二缓冲液腔214和第二扩增腔215为五个软膜，其中气源腔212为驱动第一扩增腔211提供动力；所述流体层22为两步法微流控芯片的第二层，其上还设有气源流道222和曲折流道221，气源流道222为推动第一扩增腔211中的试剂提供流道，将第一扩增腔211通过曲折流道221到达第二扩增腔215，其中曲折流道221的作用是使试剂与缓冲液相互充分混合；所述试纸条层23为两步法微流控芯片2的第三层，为胶体金纸条26提供单层储存腔室，减小加工设计难度和确保在特定时间进行试纸条层析；所述底板24为两步法微流控芯片2提供底部支撑与密封。
44.所述两步法微流控芯片2材料可以是pmma、pc或其他具有生物安全性的硬质材料，盖板21、流体层22、试纸条层23和底板24之间的键合方法可以是超声键合、热压键合、溶剂键合、胶膜粘接中的一种或多种。
45.试剂通过进样孔25滴加到第一扩增腔211后，进样孔25可由与其紧配合的密封塞29进行密闭，在密闭空气的同时，亦使得第一扩增腔211中的液体不会回流；两步法微流控芯片2还在与进样孔25同一边的对称位置设置气尾腔28，由软材料制成，作为两步法微流控芯片2中的气体出口，在保持两步法微流控芯片2整体密闭的同时还能够维持两步法微流控芯片2内气压不发生变化。
46.所述试纸条腔231宽度根据胶体金纸条26的宽度尺寸范围渐变，在距第二扩增腔215一段距离时开始收窄，到用户能够感受到胶体金纸条26摩擦力的范围，增加胶体金纸条26与试纸条腔231之间的摩擦力，从而控制胶体金纸条26的初始位置与检测位置。
47.所述第一扩增腔211、第一缓冲液腔213与第二扩增腔215之间设有一曲折流道221，第一扩增腔211中的试剂与第一缓冲液腔213中的缓冲液在流经所述曲折流道221时进行混合，使扩增效率更高。
48.所述等温检测配套装置1包括顺次连接的用户控制面板11、芯片固定区12和集成控制区13，基于等温检测配套装置1进行的核酸扩增，核酸扩增结果能够由人眼识别；智能手机3中安装有上位机软件，智能手机3与上位机通过蓝牙连接，上位机软件显示试纸条的
检测界面并调用图像算法对试纸条的核酸扩增结果进行读取识别。用户根据指示灯的提示，操作所述等温检测配套装置1上的按键，从而驱动试剂至上述扩增腔室中进行扩增，扩增结果由试纸条上的ct线显色程度指示，可由人眼识别判读或由智能手机3自动判读。
49.所述用户控制面板11包括用户控制面板前面板111、指示灯112、第一按键113和第二按键114，指示灯112、第一按键113和第二按键114设置于用户控制面板前面板111上；所述指示灯112用于提示用户操作流程及扩增进度，用户根据指示灯112的提示，适时按下第一按键113或第二按键114。
50.第一按键113和第二按键114上设有凸起和震动马达116，通过凸起控制气源腔212的气源驱动力，及第一缓冲液腔213、第二缓冲液腔214中的缓冲液流动；通过震动马达116对缓冲液与试剂的混合进行震动，以保证缓冲液与试剂充分混合。震动马达116包括第一震动马达116a、第二震动马达116b与第三震动马达116c。
51.具体地，第一按键113上设有第一凸起1131、第二凸起1132与第一震动马达116a，第二按键114上设有第三凸起1141、第二震动马达116b与第三震动马达116c；所述第一凸起1131对应气源腔212，第二凸起1132对应第一缓冲液腔213，第三凸起1141对应第二缓冲液腔214，第一震动马达116a对应第一扩增腔211，第二震动马达116b和第三震动马达116c并列布置并对应第二扩增腔215；第一凸起1131用于控制气源腔212的气源驱动力，第二凸起1132用于驱动第一缓冲液腔213中的缓冲液，第三凸起1141用于驱动第二缓冲液腔214中的缓冲液；所述第一震动马达116a用于震动第一扩增腔211，第二震动马达116b及第三震动马达116c用于震动第二扩增腔215，将第一缓冲液腔213以及第二缓冲液腔214中的缓冲液与第一扩增腔211中的试剂充分混匀。
52.具体地，所述的震动马达116通过导杆117与第二触控开关118连接，所述导杆117上套设有弹簧115，弹簧115用以复位；通过第二触控开关118对震动马达116进行通电、断电控制。
53.具体地，芯片固定区12包括芯片固定区前面板121、芯片限位侧板122、第一触控开关123、金属弹片124、第一加热模块125、第二加热模块126、芯片固定区后面板127和芯片滑槽128。芯片滑槽128设置于两步法微流控芯片2的底部，芯片固定区前面板121与芯片固定区后面板127组成两步法微流控芯片2的前后围护结构，两步法微流控芯片2被前后围护结构夹持，芯片限位侧板122设置于前后围护结构的侧部；第一触控开关123设置于芯片限位侧板122上，第一加热模块125和第二加热模块126设置于芯片固定区后面板127上，第一触控开关123与第一加热模块125和第二加热模块126连接，通过第一触控开关123对第一加热模块125和第二加热模块126进行通电、断电控制，第一加热模块125正对第一扩增腔211，第二加热模块126正对第二扩增腔215；金属弹片124设置于芯片限位侧板122上，两步法微流控芯片2沿芯片滑槽128进入等温检测配套装置1的芯片固定区12中，由金属弹片124对两步法微流控芯片2进行压紧固定。
54.具体地，集成控制区13包括电池仓131、背光源132、智能手机固定架133和主控制单元134；主控制单元134与背光源132连接；智能手机固定架133设置于集成控制区13的外侧，智能手机固定架133中能够安装智能手机3，通过智能手机3的摄像头采集/读取/识别两步法微流控芯片2中试纸条腔231的试纸条图像信息；该试纸条图像信息指的是试纸条的ct显示线。电池仓131与主控制单元134连接，背光源132为试纸条图像进行补光，以保证图像
的光照强度。
55.具体地，所述第一按键113与第二按键114为自锁按键，自锁按键上的凸起刚性连接于其背部，所述震动马达116与所述按键之间由弹簧连接，当用户第一次按下按键时，所述按键不回弹以防止试剂回流，同时，震动马达116亦与各扩增腔室的软材料面紧密接触，便于震动波从所述震动马达116向扩增腔中试剂传递；更换两步法微流控芯片2时，再次按下所述按键即可使其复位，准备下次扩增。
56.实施例1两步法微流控芯片2沿芯片滑槽128推入等温检测配套装置1的芯片固定区12，并由金属弹片124压紧固定并紧贴两加热模块；所述芯片固定区12除包括上述芯片滑槽128和金属弹片124外，还包括第一触控开关123与加热模块，所述第一触控开关123用于两步法微流控芯片2加样完成后，确认密封塞29是否到位；两个所述加热模块用于提供核酸扩增反应所需温度，包括导热金属块、温度传感器及加热片等，导热金属块与上述两步法微流控芯片2中核酸的扩增腔室紧贴，温度传感器与主控制单元134电连接，加热片紧贴导热金属块。
57.所述等温检测配套装置1的集成控制区13包括主控制单元134、供电单元与结果读出单元，所述主控制单元134与所述第一触控开关123、第一加热模块125、第二加热模块126、震动马达116及指示灯112电连接，以控制程序开始、扩增腔加热、试剂混匀及过程指示等内容，所述供电单元包括电池仓131和dc电源接口，可使用电池或电源适配器为等温检测配套装置1供电，所述结果读出单元为一配有智能手机固定架133的透明区域，不连接智能手机3时可通过透明区域观察胶体金纸条26的ct线显色，连接智能手机3时可通过上位机软件自动判读。
58.所述主控制单元134包括处理部分与数据通讯部分，所述处理部分包括数据采集电路、驱动电路和处理器，用于将第一加热模块125、第二加热模块126采集的温度数据进行处理，控制加热片功率输出，以及驱动震动马达116；所述数据通讯部分用于与无线终端连接，无线终端可以是智能手机或电脑中的一种或几种。
59.智能手机3可通过结果读出单元上的智能手机固定架133固定在所述等温检测配套装置1上，通过配套app可展示检测界面及获取胶体金纸条26的ct线图像，调用图像算法自动分析核酸扩增结果，亦可通过蓝牙与等温检测配套装置1连接，获取设定温度及实时温度；同时，可将核酸扩增结果上传至数据中心进行分析，掌握一定区域的整体核酸扩增情况。
60.实施例2本发明实施例提供一种两步法核酸扩增检测微流控芯片及检测装置，包括两步法微流控芯片2与等温检测配套装置1，试剂进样及驱动、核酸扩增和扩增结果指示直接在两步法微流控芯片2内完成，同时两步法微流控芯片2与外界空气隔绝，杜绝了气溶胶污染，且试剂驱动方式为按压，不依赖电力驱动，简化了装置设计并降低了仪器成本；等温检测配套装置1集成用户简便操作界面、试剂震动混匀、温度控制、数据传输与通讯等功能为一体，通过紧凑优化的结构设计压缩了装置尺寸，实现了手持式设计；同时，可根据不同的场景或精度需求，将检测元件（智能手机3）移除或加入等温检测配套装置1，在确保检测效果的同时，显著降低了仪器成本，提高了仪器使用灵活性。
61.本发明实施的完整检测流程如下，首先将制作好的两步法微流控芯片2沿芯片滑
槽128插入等温检测配套装置1的芯片固定区12中，把配置好的试剂从进样孔25加入第一扩增腔211内；盖好密封塞29后，第一触控开关123被触发，指示灯112亮，程序开始运行：第一震动马达116a开始震动以混合试剂，主控制单元134控制第一加热模块125开始升温，并通过实时采集的第一加热模块125内部的温度传感器信号实时对第一加热模块125的功率进行调整，再经过10-20分钟后，第一步扩增完成，主控制单元134控制第一加热模块125和第一震动马达116a终止运行，通过指示灯112的熄灭及灯亮，指示第一步等温扩增反应完成。
62.随后，按下第一按键113，其上的刚性连接的第一凸起1131挤压气源腔212表面的软材料，并最终将气源腔212中空气完全挤出；由于第一扩增腔211与气源腔212之间由气源流道222连接，在气压的作用下，第一扩增腔211内的试剂会经由曲折流道221注入第二扩增腔215，同时，第一按键113上的另一刚性连接的第二凸起1132挤压第一缓冲液腔213表面的软材料，并最终将第一缓冲液腔213中的缓冲液完全挤出，经曲折流道221与第一扩增腔211中的试剂充分混合后，最终进入第二扩增腔215中。
63.按下第一按键113的同时，第二触控开关118会被触发，指示灯112亮，第二震动马达116b与第三震动马达116c开始震动以混匀第二扩增腔215中的试剂，同时第二加热模块126开始升温，10-20 分钟后第二步等温扩增反应完成，指示灯112亮，此时第二震动马达116b与第三震动马达116c持续震动，第二加热模块126停止控温。
64.紧接着，按下第二按键114，其上刚性连接的第三凸起1141挤压第二缓冲液腔214表面的软材料，并最终将第二缓冲液腔214中的试剂完全挤出，在气压的作用下，第二缓冲液腔214中的液体最终注入第二扩增腔215中，此时第二震动马达116b与第三震动马达116c继续震动混合3~5分钟，随后停止。
65.此时，两步核酸扩增均已结束，可将胶体金纸条26向下推至检测位置，开始层析反应，约2~5分钟后，可根据胶体金纸条26上的ct线显色程度判读扩增结果，可肉眼观察，也可连接至智能手机3，在配套编写的app界面上获取经图像算法自动判读的核酸扩增结果。
66.本发明的描述是为了示例和描述起见而给出的，而并不是无遗漏的或者将本发明限于所公开的形式。很多修改和变化对于本领域的普通技术人员而言是显然的。选择和描述实施例是为了更好说明本发明的原理和实际应用，并且使本领域的普通技术人员能够理解本发明从而设计适于特定用途的带有各种修改的各种实施例。