点蜂缘蝽分泌蛋白RpSP4043及其在大豆“症青”防控中的应用

本发明涉及基因工程领域，涉及一种点蜂缘蝽分泌蛋白rpsp4043的dsrna合成、dsrna导入点蜂缘蝽体内以及该基因在防治大豆“症青”相关病害中的应用。

背景技术：

1、近年来，大豆“症青”在我国各大豆产区呈爆发式出现，在黄淮海地区尤为严重。大豆“症青”具体表现为品种生育期结束，应进入成熟期时，植株茎、叶及豆荚仍滞绿不衰老，荚而不实或籽粒发育不良，形成瘪粒畸形等。

2、点蜂缘蝽(riptortus pedestris)是大豆田间常见的刺吸式害虫，主要通过其刺吸式口器持续刺吸植株和种子汁液来获取养分。点蜂缘蝽的持续取食会导致大豆植株的发育不良甚至死亡，且受到侵害的大豆种子也往往无法正常发育，最终导致大豆的减产。目前点蜂缘蝽的防控以常规农药为主，主要包括：1％甲氨基阿维菌素苯甲酸盐乳油(甲维盐)、2.5％高效氯氟氰菊酯乳油以及50％氟啶虫胺腈水分散粒剂等；然而传统农药的大面积使用不仅造成严重的环境问题，还使得点蜂缘蝽产生了抗药性，更加难以有效防控，不利于农业的可持续发展。因此，开发新的点蜂缘蝽防治技术是解决当前化学农药滥用的良好途径和一劳永逸地解决大豆“症青”病害的应有之义。

3、虽然生物防治具有一定的作用且对环境比较友好，但其见效慢，效果差，受周围环境影响较大。转基因植物可以有效的防治害虫，但长期以往会诱导害虫抗性增加，其他非靶标害虫的危害加重，并且转基因植物的安全性仍存在争议。rna干扰(rnai)现象自1990年在植物中发现后，迅速发展，在2001年首次报道了在哺乳动物培养细胞中成功诱导了特异性靶基因表达沉默。rnai技术即通过导入小分子双链rna特异性地降解或抑制靶标基因mrna表达，进而抑制或关闭特定基因。rnai具备高效率、高特异性、操作简便等优点，因此可作为一种理想的害虫物种特异性防治体系。rnai技术在昆虫领域应用非常广泛，并且利用该技术进行害虫防治的报道也屡见不鲜。对玉米根萤叶甲、棉铃虫和甜菜夜蛾等害虫的防治案例已经证明了rnai技术作为一种新型的害虫防治手段的可行性。此外，近年来，已有研究人员借助rna干扰技术以点蜂缘蝽为实验材料进行相关功能研究，例如：tomoko ikeno团队研究了生物钟基因clock在riptortus pedestris的昼夜节律中的作用和繁殖滞育的光周期调控(tomoko ikeno et al，2013),jang团队发现duox表达的气管特异性，通过rnai干扰下调该基因导致其呼吸系统的崩溃(seonghan jang et al，2021)；然而，这些研究更多的是机理性研究，应用性不强，目前仍缺乏更有效、更环保的点蜂缘蝽病虫害防治技术；现有防治技术存在的诸多问题已经使得人们不得不寻求更好的点蜂缘蝽防治办法。

4、目前，虽然相关研究报道点蜂缘蝽与大豆“症青”的发生密切相关，但关键致病因子尚不明确，且国内外尚未见利用rnai技术防治点蜂缘蝽，从而减弱大豆“症青”发生的报道。基于以上现有技术中的缺陷，本专利的发明人通过靶向点蜂缘蝽分泌蛋白rpsp4043，建立点蜂缘蝽的rna干扰系统以及点蜂缘蝽rpsp4043基因突变体，从而降低点蜂缘蝽对大豆的致病力，减轻大豆“症青”的发生。基于室内建立的大豆“症青”发生的实验模型，结果表明：沉默rpsp4043基因能够显著降低点蜂缘蝽对大豆植株上的致病力，达到防控大豆“症青”的目的。

5、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：通过本发明获得rpsp4043基因的dsrna，将其导入点蜂缘蝽沉默rpsp4043基因后，能够显著降低点蜂缘蝽对大豆的致病力，大豆“症青”症状减轻，具体提现为瘪荚率及生育期均恢复到与对照植株无显著差异。本发明明确了rpsp4043基因在点蜂缘蝽为害大豆中的重要作用，为大豆“症青”防控提供了理论依据和现实策略。

技术实现思路

1、本发明克隆点蜂缘蝽分泌蛋白rpsp4043的部分序列，通过体外合成方法获得rpsp4043基因的dsrna，并将其导入点蜂缘蝽体内。沉默rpsp4043基因能够显著降低点蜂缘蝽在大豆植株上的存活率，从而达到防控点蜂缘蝽的目的。

2、一方面，本发明涉及一种点蜂缘蝽分泌蛋白rpsp4043基因,其核苷酸序列如seqid no.1所示或与seq id no.1具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的核苷酸或由其组成；

3、另一方面，本发明涉及一种点蜂缘蝽分泌蛋白rpsp4043基因,其氨基酸序列为seqid no.8所示的氨基酸或与seq id no.8所示的氨基酸具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸或由其组成；

4、在一些实施方案中，所述rpsp4043核苷酸序列如下(seq id no.1)：

5、atgaaatctatactctgtctagtacttgtcatttatgcaatagacgccattttcggtgtctcagtcgtcatcaacaaccataaggtctacgtggacgaaaagcccgtcgacctgtccaagctcgaagtggtggaagacaccgagttcgctacccgctacctcctccattcgggtgacaccaacatcaccatcaccaagagcaagttcggcgatgccatatccgtctcctcctcctctcacatgacccccgaggaactcgctaaggctaaggagttcagtaagaagctctccgaaaagattgaacaaaacgtcaagaacatccagaagcaagtcgaagaccagataaagaacattcaaaagagtatccaggaaaatttgaaaaaatcattcagttttttcccatttttctaa；

6、rpsp4043氨基酸序列如下(seq id no.8)：

7、mksilclvlviyaidaifgvsvvinnhkvyvdekpvdlsklevvedtefatryllhsgdtnititkskfgdaisvsssshmtpeelakakefskklsekieqnvkniqkqvedqikniqksiqenlkksfsffpff

8、另一方面，本发明还涉及一种rpsp4043基因的克隆方法，步骤包括：

9、(1)取点蜂缘蝽成虫唾液腺，trizol法提取总rna，反转录获得cdna第一条链；

10、(2)以步骤(1)中获得的点蜂缘蝽cdna为模板，以序列seq id no.2和seq id no.3所示的上下游引物进行pcr扩增；

11、(3)将上述扩增获得的基因片段连接克隆载体pbingfp，转化到大肠杆菌dh5α，在含有卡那霉素的lb固体培养基上培养，获得含有基因片段的单克隆菌落。

12、(4)挑取单克隆菌落在含有卡纳霉素的lb液体培养基中扩大培养，抽提质粒，进行dna测序，得到含有如seq id no.1所示目的序列的bin-rpsp4043；

13、(5)以bin-rpsp4043质粒为模板，利用seq id no.6所示的上游引物seq id no.7所示的下游引物进行pcr扩增，获得大量含有t7启动子的rpsp4043基因片段。

14、另一方面，本发明涉及一种rpsp4043基因的dsrna合成方法，具体步骤包括：

15、(1)以pcr扩增获得的基因片段为模板合成dsrna，反应体系为：10×reactionbuffer 2μl，atp solution 2μl，utp solution 2μl，ctp solution 2μl，gtp solution 2μl，t7rna polymerase 2μl，dna模板1μg，rnase-free h2o补齐至20μl，混匀，37℃反应8h；

16、(2)向体系中加入1μl dnase，37℃反应15min；

17、(3)取反应后的样品65℃变性5min，测定dsrna浓度，并通过1％琼脂糖凝胶电泳确定rna质量；

18、(4)将剩余dsrpsp4043储存于-80℃备用。

19、另一方面，本发明还涉及一种将ds rpsp4043导入点蜂缘蝽，减轻大豆“症青”的方法：

20、(1)利用rnase-free h2o配置注射液，稀释(1)中合成的dsrna至终浓度为4000ng/ml。选取羽化后3-10天的点蜂缘蝽成虫(不区分雌虫雄虫)，通过显微注射仪导入dsrna，置于养虫笼中饲养24h，用于后续接虫实验。

21、(2)选择北方早熟大豆品种“蒙豆16”为大豆材料，将始荚期的大豆植株分别放入统一规格的防虫网中(35cm×35cm×115cm)，分别将导入rpsp4043和gfp的dsrna的点蜂缘蝽接入始荚期的大豆，接虫密度为每株5只，取食14天；每日统计网中成虫数量和清除虫卵，取食14后，撤出虫子；待空白对照组植株进入鼓粒盛期，统计每个处理组植株的农艺性状，包括单株豆荚数及瘪荚率，待大豆植株进入成熟期，分别统计每个处理组植株的生育期天数。

22、(3)取撤出虫笼的点蜂缘蝽唾液腺，提取总rna，并反转录获得cdna，利用荧光定量pcr的方法，通过seq id no.6和seq id no.7所示引物检测样品中的rpsp4043的表达水平，利用2-δδct法计算点蜂缘蝽rpsp4043基因的相对表达量，比较不同组别之间的差异，评价rpsp4043基因沉默效率。

23、另一方面，本发明还涉及特异性抑制rpsp4043基因表达的dsrna，其由前述方法合成；

24、在一些实施方案中，本发明还涉及一种体外细胞，其含有所述dsrna；

25、在一些实施方案中，本发明还涉及一种药物组合物，其包含所述dsrna以及药学可接受的载体；

26、在一些实施方案中，所述载体为纳米材料载体。

27、在一些实施方案中，本发明还涉及所述dsrna及其相关药物组合物在制备杀虫剂中的用途；

28、另一方面，本发明还涉及一种点蜂缘蝽防治方法，将所述dsrna或者包含dsrna的药物组合物喷洒植株；

29、在一些实施方案中，本发明还一种减轻或防治大豆“症青”的方法，将所述dsrna或者药物组合物喷洒大豆植株。

30、本发明至少取得了以下有益效果为：

31、通过本发明获得rpsp4043基因的dsrna，将其导入点蜂缘蝽沉默rpsp4043基因后，能够显著降低点蜂缘蝽对大豆的致病力，大豆“症青”症状减轻，具体提现为瘪荚率及生育期均恢复到与对照植株无显著差异。本发明明确了rpsp4043基因在点蜂缘蝽为害大豆中的重要作用，为大豆“症青”防控提供了理论依据和现实策略。