一种氧化石墨烯-多重qPCR检测新型冠状病毒的试剂盒和方法

本发明属于微生物分子诊断领域，具体涉及一种氧化石墨烯-多重qpcr检测新型冠状病毒的试剂盒和方法。

背景技术：

1、新型冠状病毒主要通过呼吸道传播，在人群中极易传播，容易造成聚集性感染，因此检测新冠病毒尤为重要。目前，反转录定量聚合酶链反应(rt-qpcr)被认为是新型冠状病毒检测的金标准。然而，传统的rt-qpcr不能充分满足筛查新型冠状病毒感染的临床需求，并增加了新型冠状病毒二次传播的潜在风险。多重qpcr可同时检测不同的目标基因，但由于系统的复杂性和不同扩增反应之间可能存在的干扰，其在临床诊断中的应用较少。因此，需要一种新型的或改进的、高灵敏度的多重qpcr系统来提高新型冠状病毒检测的准确性。

2、go是石墨烯的氧化衍生物，具有六角形蜂窝结构的sp2区域和与含氧官能团相连的sp3碳基区。sp2区域使go对芳香族具有亲和力，并具有荧光淬灭能力。此外，连接到sp3区域的亲水基团使go在水溶液中稳定。go通过π-π堆叠和氢键来吸附ssdna。基于这一特性，有研究表明go-qpcr在疾病诊断中具有良好的检测性能；另外，目前也有利用go提高多重pcr反应灵敏度和特异性的报道，例如公开号为cn105603055a的中国专利申请，在多重pcr反应体系中直接添加go，提高了目标产物的特异性和产量，有助于抑制非特异性扩增，但其所用的go的自身性能特点未知。

3、然而，对于多重qpcr检测而言，体系组成比多重pcr更为复杂，影响因素众多，特别是go自身的性能、制备工艺及其在反应体系中的用量等参数会对多重qpcr检测效果带来何种影响难以预料，如何更显著地提升多重qpcr检测的灵敏度和特异性，提高对新型冠状病毒检测的准确性，仍需要进一步探索。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种灵敏度很高的氧化石墨烯-多重qpcr检测新型冠状病毒的试剂盒和方法。

2、本发明提供了一种氧化石墨烯，所述氧化石墨烯中sp2杂化的碳原子与sp3杂化的碳原子的数量比为1:(0.5～1.5)。

3、进一步地，上述氧化石墨烯中sp2杂化的碳原子与sp3杂化的碳原子的数量比为1:1。

4、进一步地，上述氧化石墨烯是嵌锰石墨溶液与双氧水反应制备而成，所述嵌锰石墨溶液和双氧水的体积比为5:(1～5)，优选为5:2.5；

5、所述嵌锰石墨溶液按照如下方法制备而成：

6、(1)石墨粉、硝酸钾加入浓硫酸混匀得到体系a；高锰酸钾、硝酸钾和浓硫酸混匀得到体系b；

7、(2)将体系b分次加入体系a中，混匀后密封，自然沉降20～40天后再搅拌均匀。

8、本发明还提供了一种氧化石墨烯-引物复合体，它是上述的氧化石墨烯与基因引物复合而成，所述基因引物是新型冠状病毒特异性靶基因的引物。

9、进一步地，上述基因引物是新型冠状病毒rdrp基因和/或e基因的正向引物；优选地，所述rdrp基因正向引物序列如seq id no.1所示；所述e基因正向引物序列如seq idno.4所示。

10、进一步地，上述复合体是氧化石墨烯溶液与基因引物混合后50℃孵育25～35分钟，再超声25～35分钟制备而成；所述氧化石墨烯溶液浓度为5.21～23.46μg/ml，优选为10.11～13.44μg/ml，更优选为13.44μg/ml。

11、本发明还提供了一种检测新型冠状病毒的试剂盒，包括上述的氧化石墨烯-引物复合体。

12、进一步地，上述氧化石墨烯-引物复合体是氧化石墨烯分别与新型冠状病毒rdrp基因和e基因的正向引物复合而成的复合体；所述试剂盒还包括新型冠状病毒rdrp基因和e基因的反向引物；所述rdrp基因反向引物序列如seq id no.2所示；所述e基因反向引物序列如seq id no.5所示；

13、优选的，所述试剂盒还包括新型冠状病毒rdrp基因和e基因的检测探针，所述rdrp基因的检测探针序列如seq id no.3所示，所述e基因的检测探针序列如seq id no.6所示；所述检测探针修饰有荧光报告基团和荧光淬灭基团；

14、更优选地，所述试剂盒还包括内参基因的正向引物、反向引物和检测探针；所述检测探针修饰有荧光报告基团和荧光淬灭基团。所述内参基因优选为rnase p基因，所述rnase p基因的正向引物序列如seq id no.7所示，反向引物序列如seq id no.8所示，探针序列如seq id no.9所示。

15、进一步地，上述试剂盒还包括探针预混液、无酶水。

16、本发明还提供一种检测新型冠状病毒的方法，包括如下步骤：

17、(1)上述试剂盒的组分与待测样本混匀，孵育；

18、(2)检测扩增产物；所述检测是琼脂糖凝胶电泳、荧光检测或胶体金试纸条检测；

19、优选地，所述试剂盒包括型冠状病毒rdrp基因、e基因和rnase p基因的检测探针；所述检测扩增产物是荧光检测，更优选为实时荧光pcr检测。

20、本发明的有益效果：本发明采用改良的hummers方法调节go氧化程度制备得到具有适当的sp2和sp3比例的go，用其吸附目标基因的正向引物构建go-正向引物复合体，应用于多重qpcr检测新型冠状病毒的反应体系中，与其他sp2和sp3比例的go-正向引物复合体建立的多重qpcr检测新型冠状病毒的反应体系相比，检测灵敏度显著提升；同时，还兼具优异的特异性，可以实现对新型冠状病毒的快速、灵敏、准确检测，具有推广应用价值。

21、本发明术语“浓硫酸”是指浓度大于或等于70％的硫酸溶液，最常用浓硫酸的浓度为98％。

22、“新型冠状病毒”指sars-cov-2。

23、本发明“rdrp基因”是：the rna-dependent rna polymerase(rdrp)gene；基因id:30897989。

24、“e基因”是envelope(e)coding gene；基因id:43740570。

25、“rnase p基因”是：the human ribonuclease p gene；基因id:10556。

26、显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

27、以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

技术特征：

1.一种氧化石墨烯，其特征在于，所述氧化石墨烯中sp2杂化的碳原子与sp3杂化的碳原子的数量比为1:(0.5～1.5)。

2.如权利要求1所述的氧化石墨烯，其特征在于，所述氧化石墨烯中sp2杂化的碳原子与sp3杂化的碳原子的数量比为1:1。

3.如权利要求1或2所述的氧化石墨烯，其特征在于，所述氧化石墨烯是嵌锰石墨溶液与双氧水反应制备而成，所述嵌锰石墨溶液和双氧水的体积比为5:(1～5)，优选为5:2.5；

4.一种氧化石墨烯-引物复合体，其特征在于，它是权利要求1～3任一项所述的氧化石墨烯与基因引物复合而成，所述基因引物是新型冠状病毒特异性靶基因的引物。

5.如权利要求4所述的复合体，其特征在于，所述基因引物是新型冠状病毒rdrp基因和/或e基因的正向引物；优选地，所述rdrp基因正向引物序列如seq id no.1所示；所述e基因正向引物序列如seq id no.4所示。

6.如权利要求4所述复合体，其特征在于，它是氧化石墨烯溶液与基因引物混合后50℃孵育25～35分钟，再超声25～35分钟制备而成；所述氧化石墨烯溶液浓度为5.21～23.46μg/ml，优选为10.11～13.44μg/ml，更优选为13.44μg/ml。

7.一种检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求4～6任一项所述的氧化石墨烯-引物复合体。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述氧化石墨烯-引物复合体是氧化石墨烯分别与新型冠状病毒rdrp基因和e基因的正向引物复合而成的复合体；所述试剂盒还包括新型冠状病毒rdrp基因和e基因的反向引物；所述rdrp基因反向引物序列如seq id no.2所示；所述e基因反向引物序列如seq id no.5所示；

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括探针预混液、无酶水。

10.一种检测新型冠状病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：

技术总结
本发明公开了一种氧化石墨烯‑多重qPCR检测新型冠状病毒的试剂盒和方法，属于微生物分子诊断领域。本发明提供了一种具有特定sp<supgt;2</supgt;和sp<supgt;3</supgt;杂化比例的氧化石墨烯，以及该氧化石墨烯与目标基因检测正向引物的复合体。利用该复合体进行多重qPCR检测，能够在兼具优异特异性的同时显著提升检测灵敏度，可以实现对新型冠状病毒的快速、灵敏、准确检测，具有推广应用价值。

技术研发人员：何洋,曾源远
受保护的技术使用者：成都中医药大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12