一种萜类合酶在制备龙脑中的应用

本发明涉及药用植物分子生物学和基因工程，更具体地说是涉及高效合成龙脑的龙脑基二磷酸合酶aartps89蛋白、编码基因和应用。

背景技术：

1、艾(artemisia argyi)为菊科蒿属药用植物，主要集中在东亚地区，在俄罗斯等远东地区也有发现。其全草入药，有温经散寒、止血消炎等功效，在民俗、保健、饮食和医药等方面已有数千年的历史。艾叶晒干制成艾条用于艾灸，可以治疗结肠炎、腹泻、尿失禁、痛经、膝关节骨性关节炎、哮喘等多种病症。此外，艾蒿熏蒸抑菌、艾蒿香包防虫也是常见应用。

2、萜类化合物是艾中一类非常重要的化合物，主要为单萜类化合物及其衍生物，例如1,8-桉油精、龙脑、侧柏酮、樟脑等；以及倍半萜类化合物及其衍生物，例如石竹烯、氧化石竹烯、吉马烯d等。在2020版《中国药典》中规定了桉油精以及龙脑为指标性成分。其中龙脑具有驱肠虫，解热，解除平滑肌痉挛，祛痰等作用，还是一种重要的工业原料。

3、龙脑基二磷酸合酶(bornyl diphosphate synthase,bpps)是一种特殊的单萜合酶，它能催化一种特殊的反应，即在gpp环化的过程中，磷酸基团经历了脱离并重新与碳正离子结合的过程，生成了含有磷酸基团、溶于水的龙脑基二磷酸(bornyl diphosphate,bpp)。当用碱性磷酸酶对龙脑基二磷酸进行脱焦磷酸反应后，能够生成最终产物龙脑。最早的bpps是在芳香植物撒尔维亚(salvia officinalis)中克隆到的，sobpps是一个多产物酶；此后，在薰衣草、甜舌草、砂仁等多种植物中被克隆到，但是与sobpps类似，酶的催化效率不专一，均有副产物产生。

4、aartps89是艾萜类合酶基因家族中的成员，属于tps-b亚家族。研究发现，aartps89在体外催化生成龙脑基二磷酸，并进一步在去磷酸化酶的作用下生成单一产物龙脑，具有底物特异性和产物专一性，被鉴定为龙脑基二磷酸合酶。因此，如何利用aartps89基因，将其构建表达载体，并在生物体中合成龙脑是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种aartps89蛋白、编码基因和应用。

2、本发明首先提供了一种蛋白，包括如下1)-3)所示：

3、1)seq id no.1所示的氨基酸序列；

4、2)与seq id no.1所示的序列具有相同功能，且通过取代缺失或增加一个或多个氨基酸而获得的序列；

5、3)与seq id no.1所示的蛋白质具有相同功能，且n端或c端连接标签得到的融合蛋白质。

6、上述蛋白质，蛋白标签是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。

7、还提供了一种编码权利要求1所述蛋白的编码基因，其中，所述编码基因为如下中至少一种：

8、1)seq id no.2所示的核苷酸序列；

9、2)在严格条件下与1)限定的核苷酸序列杂交且编码权利要求1所述蛋白质的dna分子；

10、3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有90％以上的同一性且编码权利要求1所述蛋白质的核苷酸序列；

11、4)由seq id no.2所示的序列通过取代、缺失或增加核苷酸而获得的序列；

12、5)由seq id no.2所示的核苷酸序列产生不同的转录本或者同源基因序列。

13、还提供了一种含有所述编码基因的重组载体、表达盒、重组菌、重组细胞、转基因植物。

14、基于艾全基因组及不同器官/组织转录组差异表达分析以及与已知功能的bpps蛋白构建系统发育进化树分析，筛选出可能参与樟脑合成的bdh基因seq id no.2所示的核苷酸序列，或与所述的核苷酸序列与表达载体重组后导入到受体微生物中，表达载体具体为pet-28a，受体微生物具体为大肠杆菌bl21(de3)，得到表达aartps89蛋白质或与其具有相同功能的蛋白质的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到蛋白。

15、还提供了所述的编码基因在催化香叶基焦磷酸生成龙脑中的应用。

16、还提供了所述的重组载体、表达盒、重组菌、重组细胞、转基因植物在催化香叶基焦磷酸生成龙脑中的应用。

17、还提供了一种扩增所述编码基因的引物，所述引物如seq id no.3～se q idno.4所示。

18、还提供了一种制备所述的1)-3)蛋白质方法，所述方法包括：将所述编码基因的核苷酸序列与表达载体重组后导入到受体微生物中，得到重组菌株，培养所述重组菌株，表达得到所述的蛋白质。

19、还提供了一种制备龙脑的方法，所述方法包括用所述的1)-3)蛋白质催化香叶基焦磷酸生成龙脑。通过ni nta树脂纯化aartps89蛋白，在缓冲液中进行aartps89蛋白体外酶促反应和去磷酸化酶反应，通过固相微萃取技术和气质联用(gc-ms)技术检测aartps89基因在原核表达体系体外的催化产物，获得催化产物龙脑。

20、本发明从艾中克隆得到aartps89即龙脑基二磷酸合酶，该基因是首次从艾中得到的重要指标性成分单萜类化合物龙脑合成的关键酶基因。通过实验证明本发明的aartps89能够催化gpp形成龙脑，这对进一步解析艾中萜类化合物的合成具有重要作用，对进一步提高龙脑产量，增强药材品质具有重要意义。

技术特征：

1.一种蛋白，其特征在于，包括如下1)-3)所示：

2.一种编码权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在：所述编码基因为如下中至少一种：

4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、表达盒、重组菌、重组细胞、转基因植物。

5.权利要求2或3所述的编码基因在催化香叶基焦磷酸生成龙脑中的应用。

6.权利要求4所述的重组载体、表达盒、重组菌、重组细胞、转基因植物在催化香叶基焦磷酸生成龙脑中的应用。

7.制备权利要求1所述的蛋白质方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求2或3所述的核苷酸序列与表达载体重组后导入到受体微生物中，得到重组菌株，培养所述重组菌株，表达得到权利要求1所述的蛋白质。

8.一种制备龙脑的方法，其特征在于：所述方法包括用权利要求1所述的蛋白质催化香叶基焦磷酸生成樟脑。

技术总结
一种萜类合酶在制备龙脑中的应用。本发明涉及了一种蛋白，包括如下1)‑3)所示：1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；2)与SEQ ID NO.1所示的序列具有相同功能，且通过取代缺失或增加一个或多个氨基酸而获得的序列；3)与SEQ ID NO.1所示的蛋白质具有相同功能，且N端或C端连接标签得到的融合蛋白质；还公开了AarTPS89基因在催化前体物质牻牛儿基焦磷酸GPP生成龙脑基二磷酸，进一步通过磷酸酶的催化作用生成龙脑的应用；其中，AarTPS89基因序列如SEQID NO.2所示。

技术研发人员：罗红梅,董树廷,陈泓宇,郭妙弦,武新玲
受保护的技术使用者：中国医学科学院药用植物研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12