多特异性融合蛋白的制备及其应用的制作方法

本申请涉及免疫学领域，更具体地，涉及一种多特异性融合蛋白的制备及其用途。

背景技术：

1、疾病的发生和发展通常与某些胞内异常的信号转导有关。小分子抑制剂是胞内信号通路的调节的主要手段，因为它们能容易地透过细胞膜进入细胞内发挥作用。但小分子药物由于结构相对简单，往往容易与多个靶点相互作用，缺乏良好的靶向选择性，特异性不高而导致副作用偏大。

2、与小分子抑制剂相比，生物大分子在结构以及功能多样性方面更具有优势，且具有较好的特异性。如果能将功能性蛋白质输送到细胞中作为激活或拮抗特定信号通路的干预手段，则在某些疾病治疗领域将会有更广阔的发挥空间。然而，由于蛋白等大分子难以透过细胞膜，其针对胞内靶点的治疗仍面临非常大的挑战。目前开发的大分子药物绝大多数是针对细胞表面靶点(zhang,y.；j.j.；lee,k.；li,j.；murthy,n.recentdevelopments in intracellular protein delivery.curr.opin.biotechnol.2018,52,25-31.(2)simeon,r.；chen,z.in vitro-engineered non-antibody proteintherapeutics.protein cell 2018,9,3-14)。要实现大分子药物对胞内信号的干预调节，首先必须解决大分子向胞内选择性递送的问题。

3、截至目前，也有一些策略用于解决大分子向胞内的递送。比如基于脂质或聚合物的转染试剂，但转染试剂一方面会存在某些细胞毒性，另一方面针对难以转染的细胞或原代细胞很难实现大分子的递送(chang,h.；lv,j.；gao,x.；wang,x.；wang,h.；chen,h.；he,x.；li,l.；cheng,y.rational design of a polymer with robust efficacy forintracellular protein and peptide delivery.nano lett.2017,17,1678-1684)。还可以借助细胞穿透肽(cell-penetrating peptides，cpp)实现蛋白等大分子递送，目前基于cpp的很多研究进入临床。但目前也有研究发现，cpp在输送蛋白质或多肽时，由于蛋白水解作用和快速的肝肾清除而导致其血浆半衰期较短，导致cpp稳定性较差，另一方面cpp介导穿膜时缺乏组织特异性和细胞类型特异性，使得药物无法在特定靶细胞内定向积累，因而对正常组织和细胞的损伤较大(bolhassani,a.；jafarzade,b.s.；mardani,g.in vitroand in vivo delivery of therapeutic proteins using cell penetratingpeptides.peptides2017,87,50-63)。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本申请提供了一种融合蛋白，其能特异性结合细胞膜表面的抗原并且介导细胞内吞，然后与细胞内下游的信号分子结合，从而对信号通路进行干预。具体而言，本申请提供了以下技术方案：

2、在第一方面，本申请提供了一种融合蛋白，其包含：

3、a)能特异性结合第一靶点的fab片段，所述fab片段能借助与所述第一靶点的结合使所述融合蛋白被细胞内化；

4、b)能特异性结合第二靶点的第一多肽，所述第一多肽的n端通过第一肽接头与所述fab片段的轻链或重链的c端连接，所述第二靶点在所述第一靶点所涉及的信号通路的下游，

5、任选地，所述融合蛋白还包含：

6、c)能特异性结合第三靶点的第二多肽，所述第二多肽的n端通过第二肽接头与所述fab片段的重链或轻链的c端连接，所述第三靶点在所述第一靶点所涉及的信号通路的下游，

7、其中所述第一肽接头和所述第二肽接头之间仅能形成一个二硫键，并且各自独立地选自以下：包含seq id no：14-15所示序列中的任一种的肽接头，其中x代表除cys的任意氨基酸，或者缺失，任选地，所述第一肽接头和/或所述第二肽接头为天然抗体的铰链区，其中对铰链区进行仅保留一个半胱氨酸的突变，任选地，所述第一肽接头和/或所述第二肽接头为c239缺失突变的igg1铰链区。

8、在第二方面，本申请提供了一种核酸，其编码第一方面所述的融合蛋白。

9、在第三方面，本申请提供了一种表达载体，其包含第二方面所述的核酸。

10、在第四方面，本申请提供了一种宿主细胞，其包含第二方面所述的核酸或第三方面所述的表达载体。

11、在第五方面，本申请提供了制备第一方面所述的融合蛋白的方法，其包括：

12、a)培养第四方面所述的宿主细胞；和

13、b)从所述宿主细胞中或所述宿主细胞的培养物上清中回收所述融合蛋白。

14、在第六方面，本申请提供了药物组合物，其包含第一方面所述的融合蛋白，第二方面所述的核酸，第三方面所述的表达载体或第四方面所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体。

15、在第七方面，本申请提供了第一方面所述的融合蛋白，第二方面所述的核酸，第三方面所述的表达载体或第四方面所述的宿主细胞在制备用于治疗、改善或预防肿瘤、代谢性疾病、免疫相关疾病或传染性疾病的药物中的用途。

16、在第八方面，本申请提供了治疗、改善或预防肿瘤、代谢性疾病、免疫相关疾病或传染性疾病的方法，其包括向有需要的个体施用第一方面所述的融合蛋白，第二方面所述的核酸，第三方面所述的表达载体或第四方面所述的宿主细胞。

17、在第九方面，本申请提供了第一方面所述的融合蛋白，第二方面所述的核酸，第三方面所述的表达载体或第四方面所述的宿主细胞用于治疗、改善或预防肿瘤、代谢性疾病、免疫相关疾病或传染性疾病的用途。

18、本申请中制备的融合蛋白具有以下优势之一：

19、1.表达量高，哺乳动物细胞293fv中瞬转表达量达约50-100mg/l；

20、2.纯度高，纯度达到95％以上；

21、3.融合蛋白部分的构象不会影响n端抗体部分与对应抗原的亲和力及亲合力；以及

22、4.融合蛋白具有胞外到胞内双重或多重靶点的干预，尤其在干扰胞内信号通路的同时，对有害细胞例如肿瘤细胞起到更好的抑制增殖效果。

技术特征：

1.一种融合蛋白，其包含：

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述第一肽接头与所述第一多肽之间和/或所述第二肽接头与所述第二多肽之间还连接有第三肽接头和第四肽接头，任选地，所述第三肽接头和所述第四肽接头各自独立地包含以下的一种或多种：seq id no：18所示的序列、seqid no:19所示的序列、串联连接的多个seq id no：18所示的序列和串联连接的多个seq idno：19所示的序列。

3.如权利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述第一靶点选自c-met、egfr、epha2以及以上的组合，任选地，其中所述fab片段的轻链和重链通过凸起一进入一孔洞形成异源二聚体，任选地，其中所述凸起一进入一孔洞位于轻链和重链的恒定区中。

4.如前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述第一多肽和所述第二多肽各自独立地选自mbd16、grb2-sh2、shp2-bound gab1以及axl胞外段，

5.一种核酸，其编码权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白。

6.一种表达载体，其包含权利要求5所述的核酸。

7.一种宿主细胞，其包含权利要求5所述的核酸或权利要求6所述的表达载体，任选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞选自cho细胞、ns0细胞、sp2/0细胞、hek293细胞、cos细胞和per.c6细胞。

8.制备权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白的方法，其包括：

9.药物组合物，其包含权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白，权利要求5所述的核酸，权利要求6所述的表达载体或权利要求7所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体。

10.权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白，权利要求5所述的核酸，权利要求6所述的表达载体或权利要求7所述的宿主细胞在制备用于治疗、改善或预防肿瘤、代谢性疾病、免疫相关疾病或传染性疾病的药物中的用途。

11.如权利要求10所述的用途，其中所述肿瘤选自肺癌、间皮质瘤、结直肠癌、膀胱癌、白血病、乳腺癌、胃癌、胃食管结合部腺癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤，间变大细胞淋巴瘤、头颈癌、恶性胶质瘤、肾癌、黑色素瘤、前列腺癌、骨癌、胰腺癌、肉瘤、肝癌、皮肤鳞癌、宫颈癌、鼻咽癌、子宫内膜癌，或上述肿瘤的转移癌，任选地，所述代谢性疾病选自糖尿病、糖尿病酮症酸中毒、高血糖高渗综合征、低血糖症、痛风、蛋白质-能量营养不良症、维生素a缺乏病、坏血病、维生素d缺乏病、骨质疏松症、肥胖症，任选地，所述免疫相关疾病选自系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、系统性血管炎和自身免疫性溶血性贫血，任选地，所述传染性疾病选自流行性感冒、结肠炎、hpv感染、乙型肝炎、狂犬病、梅毒、艾滋病。

技术总结
本申请提供了一种融合蛋白及其用途，所述融合蛋白包含：a)能特异性结合第一靶点的Fab片段，所述Fab片段能借助与所述第一靶点的结合使所述融合蛋白被细胞内化；b)能特异性结合第二靶点的第一多肽，所述第一多肽的N端通过第一肽接头与所述Fab片段的轻链或重链的C端连接，所述第二靶点在所述第一靶点所涉及的信号通路的下游，任选地，所述融合蛋白还包含：c)能特异性结合第三靶点的第二多肽，所述第二多肽的N端通过第二肽接头与所述Fab片段的重链或轻链的C端连接，所述第三靶点在所述第一靶点所涉及的信号通路的下游。

技术研发人员：高新,窦晓倩,郁振军,钱尼良,李宏杰,杨翠马,陈利婷,徐桂利,潘秀颉,宋海峰
受保护的技术使用者：北京免疫方舟医药科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/31