血液胞外囊泡microRNA在鉴别上皮性卵巢肿瘤良恶性中的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域。具体地说，本发明涉及用于早期诊断卵巢癌，特别是鉴别上皮性卵巢肿瘤良恶性的血液胞外囊泡hsa-mir-21-3p及其应用。

背景技术：

1、卵巢癌是女性常见的三大恶性肿瘤之一，也是女性妇科疾病中最致命的疾病。卵巢癌由于缺乏代表性临床症状和有效的诊断方法，超过70％的患者出现盆腔外病变，诊断时已为晚期(figo分期iii期或iv期)。在过去的几十年尽管在治疗方面取得了进展，晚期患者的5年生存率仍然很低(<30％)，而早期(figo分期i期或ii期)患者的5年生存率更长，可达70-90％。针对卵巢癌，尤其是卵巢癌中最常见的病理类型--上皮性卵巢癌，准确有效的良恶性鉴别对于临床干预卵巢癌，提高干预效果和改善预后具有巨大价值。因此，早期发现并准确进行良恶性鉴别是卵巢癌患者获得高治愈率的关键途径。

2、目前，卵巢癌的筛查方法主要包括影像学检查和肿瘤生物标志物检测，或二者联合检测等形式，但临床实践表明，这些方法均有一定的局限性。影像学诊断方法主要有经阴道超声、ct扫描、磁共振成像(mri)等。影像学诊断是临床肿瘤诊断的常用方法，但由于影像设备的各种缺陷，如超声准确率较低、ct电离辐射等，通常是将几种技术结合起来进行诊断；此外，影像学诊断敏感性和特异性较低，常用于高危人群的诊断，而不是早期发现。血清标志物检测常有ca125(糖类抗原)、he4(human epididymis protein 4，人附睾蛋白4)等。ca125在卵巢癌的诊断中有许多局限性，如敏感性低，i、ii期患者术前诊断敏感性50-60％，晚期患者敏感性为70-90％，同时诊断特异性较差，ca125不仅在妇科疾病中升高，在肺癌、内分泌和消化疾病、营养代谢疾病中也升高。he4仅在大约60-75％的卵巢癌患者的血清中升高，且对原发性腹膜癌、原发性输卵管癌等腹腔多发肿瘤的敏感性，限制了对卵巢癌的诊断。ca125和he4这两种生物标志物在卵巢癌诊断及治疗和复发的随访监测中被广泛应用，但由于其诊断特异性和敏感性较差，仍远未达到最佳效果。

3、针对血液胞外囊泡mirna生物标志物应用于卵巢癌早期诊断的研究没有验证可用于卵巢癌早诊的生物标志物，同时也未建立高特异性的血液胞外囊泡mirna生物标志物诊断模型。目前，能够用于良、恶性上皮性卵巢肿瘤鉴别的高特异性的血液胞外囊泡mirna生物标志物更是未见研究和报道。具体地说，现有技术中存在以下缺点：1)临床上广泛使用的影像学检查(如经阴道超声)和肿瘤标志物检测(如ca125)，对卵巢癌的诊断缺乏特异性，易出现假阳性。并且这些指标并不能够用于上皮性卵巢肿瘤良恶性鉴别判断；2)尚没有可辅助经阴道超声和ca125的高特异性生物标志物，以提高卵巢癌诊断特异性，从而降低假阳性率；3)目前临床上尚未有成熟的基于血液外泌体mirna鉴别良恶性上皮性卵巢肿瘤的产品或诊断试剂盒；和4)目前临床上缺乏基于血液外泌体对上皮性卵巢癌进行有效诊断鉴别的液体活检技术方案。

4、因此，在卵巢癌常规诊断方法的基础上，迫切需要开发新的生物标志物来提高卵巢癌诊断鉴别效能。

技术实现思路

1、本发明旨在发现并验证可用于上皮性卵巢肿瘤良恶性鉴别诊断的、特异性高的血液胞外囊泡mirna生物标志物及诊断模型。同时，该液体活检鉴别技术可以结合影像学检查和ca125水平检测来提高上皮性卵巢癌诊断鉴别特异性，降低假阳性，避免医疗过度，减轻患者痛苦，节约医疗资源。

2、为此，本发明提供了一种生物标志物，这种生物标志物能够在临床上对上皮性卵巢肿瘤的良恶性进行鉴别。

3、本发明还提供了能够对上皮性卵巢肿瘤的良恶性进行鉴别的芯片和试剂盒。

4、本发明还提供了利用所述生物标志物对上皮性卵巢肿瘤的良恶性进行鉴别的方法。

5、在第一方面，本发明提供一种血液胞外囊泡mirna在制备鉴别上皮性卵巢肿瘤良恶性的芯片、检测试剂或检测试剂盒中的用途。

6、在具体的实施方式中，所述的血液胞外囊泡mirna是：

7、(i)序列如seq id no:1所示的mirna；或者

8、(ii)与(i)所述mirna序列互补的mirna。

9、在优选的实施方式中，所述的mirna是分离自人的mirna。

10、在第二方面，本发明提供一种mirna芯片，所述的mirna芯片包括：

11、固相载体；以及

12、有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地结合mirna；

13、其中，所述的mirna是：

14、(i)序列如seq id no:1所示的mirna；或者

15、(ii)与(i)所述mirna序列互补的mirna。

16、在具体的实施方式中，所述的寡核苷酸探针含有：

17、互补结合区；和/或

18、与固相载体相连的连接区。

19、在具体的实施方式中，所述mirna芯片用于鉴别上皮性卵巢肿瘤的良恶性。

20、在优选的实施方式中，所述的mirna是分离自人的mirna。

21、在优选的实施方式中，所述的mirna是血液胞外囊泡mirna。

22、在第三方面，本发明提供第二方面所述的mirna芯片的用途，用于制备鉴别上皮性卵巢肿瘤良恶性的检测试剂盒。

23、在第四方面，本发明提供一种检测试剂盒，所述的检测试剂盒装有检测mirna的检测试剂；

24、其中，所述的mirna是：

25、(i)序列如seq id no:1所示的mirna；或者

26、(ii)与(i)所述mirna序列互补的mirna；

27、或者，所述检测试剂盒装有权利要求3或4所述的mirna芯片。

28、在具体的实施方式中，所述检测试剂盒用于鉴别上皮性卵巢肿瘤的良恶性。

29、在优选的实施方式中，所述的mirna是分离自人的mirna。

30、在优选的实施方式中，所述的mirna是血液胞外囊泡mirna。

31、在第五方面，本发明提供一种分离自血液胞外囊泡的mirna，用于鉴别上皮性卵巢肿瘤良恶性；

32、其中，所述的mirna是：

33、(i)序列如seq id no:1所示的mirna；或者

34、(ii)与(i)所述mirna序列互补的mirna。

35、在优选的实施方式中，所述的mirna是分离自人的mirna。

36、在优选的实施方式中，所述的mirna是血液胞外囊泡mirna。

37、在第六方面，本发明提供一种鉴别上皮性卵巢肿瘤良恶性的方法，包括步骤：

38、(a)根据训练队列mirna表达量数据，结合病理检测结果，构建良/恶性分类模型；

39、(b)以待测对象mirna表达量为变量，结合参比值，当风险值小于或等于参比值时则判定该对象为良性，否则为恶性卵巢癌；

40、所述的mirna是：

41、(i)序列如seq id no:1所示的mirna；或者

42、(ii)与(i)所述mirna序列互补的mirna。

43、在优选的实施方式中，所述的mirna是分离自人的mirna。

44、在优选的实施方式中，所述的mirna是血液胞外囊泡mirna。

45、在优选的实施方式中，所述的参比值为4.09。

46、在第七方面，本发明提供一种分离自血液胞外囊泡的mirna，所述的mirna是：

47、(i)序列如seq id no:1所示的mirna；或者

48、(ii)与(i)所述mirna序列互补的mirna。

49、在优选的实施方式中，所述的mirna是分离自人的mirna。

50、在优选的实施方式中，所述的mirna是血液胞外囊泡mirna。

51、在第八方面，本发明提供一种分离的或人工构建的前体mirna，所述的前体mirna能在人细胞内剪切并表达成所述的mirna。

52、在第九方面，本发明提供一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸能被人细胞转录成前体mirna，所述的前体mirna能在人细胞内被剪切且表达成所述的mirna。

53、在优选的实施方式中，所述的多核苷酸具有式i所示的结构：

54、seq正向-x-seq反向   式i

55、式i中，

56、seq正向为能在人细胞中表达成所述的mirna的核苷酸序列；

57、seq反向为与seq正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；

58、x为位于seq正向和seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与seq正向和seq反向不互补；

59、式i所示的结构在转入人细胞后，形成式ii所示的二级结构：

60、

61、式ii中，seq正向、seq反向和x的定义如上述，

62、||表示在seq正向和seq反向之间形成的碱基互补配对关系。

63、在第十方面，本发明提供一种载体，所述载体含有所述的mirna或所述的多核苷酸。

64、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。