血液胞外囊泡microRNA在鉴别卵巢肿瘤良恶性中的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域。具体地说，本发明涉及用于早期诊断卵巢癌，特别是鉴别上皮性卵巢肿瘤良/恶性的血液胞外囊泡mir-200c-3p及其应用。

背景技术：

1、卵巢癌是导致全球每年女性患者死亡人数最多的妇科恶性肿瘤，是起源于卵巢的癌症，随后发生侵入并转移到其他部位。根据其组织特点可将卵巢癌分为上皮细胞型、生殖细胞型和性索间质型，其中上皮型卵巢癌是最常见的卵巢癌类型，占卵巢癌90％以上，生殖细胞型卵巢癌和性索间质型卵巢癌仅占5％。由于卵巢癌通常无特异性症状，同时缺乏可靠的生物标志物，绝大多数卵巢癌确诊时已是晚期，其中超过70％的卵巢癌患者在确诊时已扩散到骨盆之外。晚期卵巢癌患者5年生存率约为20％，治疗效果不佳，预后很差，且超过70％的晚期卵巢癌患者在治疗后5年内发生复发。有报道显示确诊时为i期的卵巢癌患者经干预治疗后5年生存率约90％，说明卵巢癌患者的预后情况与确诊时的疾病阶段直接相关，所以早期发现是改善卵巢癌治疗情况的关键。因此，如何在早期对卵巢癌患者进行精准且高效的鉴别诊断具有至关重要的临床意义。

2、目前，临床上卵巢癌的诊断方法包括影像学、血清学肿瘤标志物等，但这些方法对于卵巢癌的早期诊断效果均有一定的局限性。卵巢癌的诊断影像学主要为阴道超声检查(tvs)、计算机扫描断层(ct)、核磁共振成像(mri)和pet/ct等。由于早期卵巢癌的肿瘤体积较小，卵巢形态结构的变化很小，超声检查在诊断时会产生假阴性的结果，同时大约18％-30％的其他病变信息经超声检查仍然不能确定。ct在诊断大于1cm的肿瘤时灵敏度和特异性较高，分别达到85％-95％和91-96％，但是当肿瘤体积小于1cm时其灵敏度不到25％-50％。在检测软组织时mri分辨率虽然比ct更有优势，但是检测小于5mm的肿瘤时仍然不足，所以仅作为超声检查的补充工具。pet/ct在诊断卵巢癌的特定转移部位时灵敏度欠佳，如检测小肠系膜转移和右上腹转移时灵敏度仅为64％和65％。ca-125是公认的卵巢癌血清学肿瘤标志物，但是假阳性结果的比例很高，部分良性患者ca-125水平也会升高；同时超过50％的卵巢癌早期患者血清ca-125水平并未升高。另外，he4具有与ca-125相似的敏感性，卵巢恶性肿瘤风险算法(roma指数)组合了he4和ca-125，但依然无法在低肿瘤负荷时准确检测卵巢癌。

3、因此，卵巢癌的早期诊断仍面临严峻的临床挑战，开发基于无创/微创检测方法的肿瘤标志物以提高卵巢癌鉴别诊断效果的研究刻不容缓。

技术实现思路

1、本发明目的在于建立并验证有效的血液胞外囊泡mirna生物标志物的鉴别诊断模型，补充影像学技术诊断结果，提高卵巢癌患者早期诊断效果，降低假阴性并提高阳性预测值，减少早期卵巢癌患者的漏诊和误诊，赋予更加合适的治疗方案给患者，减轻患者的痛苦及其家人的经济负担，进而提高其生活质量。

2、为此，本发明提供了一种生物标志物，这种生物标志物能够在临床上对卵巢肿瘤的良/恶性进行鉴别。

3、本发明还提供了能够对卵巢肿瘤的良/恶性进行鉴别的芯片和试剂盒。

4、本发明还提供了利用所述生物标志物对卵巢肿瘤的良/恶性进行鉴别的方法。

5、在第一方面，本发明提供血液胞外囊泡mirna在制备鉴别上皮性卵巢肿瘤良恶性的芯片、检测试剂或检测试剂盒中的用途。

6、在具体的实施方式中，所述的血液胞外囊泡mirna是：

7、(i)序列如seq id no:1所示的mirna；或者

8、(ii)与(i)所述mirna序列互补的mirna。

9、在优选的实施方式中，所述的mirna是分离自人的mirna。

10、在第二方面，本发明提供一种mirna芯片，所述的mirna芯片包括：

11、固相载体；以及

12、有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地结合mirna；

13、其中，所述的mirna是：

14、(i)序列如seq id no:1所示的mirna；或者

15、(ii)与(i)所述mirna序列互补的mirna。

16、在具体的实施方式中，所述的寡核苷酸探针含有：

17、互补结合区；和/或

18、与固相载体相连的连接区。

19、在具体的实施方式中，所述mirna芯片用于鉴别上皮性卵巢肿瘤的良/恶性。

20、在优选的实施方式中，所述的mirna是分离自人的mirna。

21、在优选的实施方式中，所述的mirna是血液胞外囊泡mirna。

22、在第三方面，本发明提供第二方面所述的mirna芯片的用途，用于制备鉴别上皮性卵巢肿瘤良/恶性的检测试剂盒。

23、在第四方面，本发明提供一种检测试剂盒，所述的检测试剂盒装有检测mirna的检测试剂；

24、其中，所述的mirna是：

25、(i)序列如seq id no:1所示的mirna；或者

26、(ii)与(i)所述mirna序列互补的mirna；

27、或者，所述检测试剂盒装有第二方面所述的mirna芯片。

28、在具体的实施方式中，所述检测试剂盒用于鉴别上皮性卵巢肿瘤的良/恶性。

29、在优选的实施方式中，所述的mirna是分离自人的mirna。

30、在优选的实施方式中，所述的mirna是血液胞外囊泡mirna。

31、在第五方面，本发明提供一种分离自血液胞外囊泡的mirna，用于鉴别上皮性卵巢肿瘤良/恶性；

32、其中，所述的mirna是：

33、(i)序列如seq id no:1所示的mirna；或者

34、(ii)与(i)所述mirna序列互补的mirna。

35、在优选的实施方式中，所述的mirna是分离自人的mirna。

36、在优选的实施方式中，所述的mirna是血液胞外囊泡mirna。

37、在第六方面，本发明提供一种鉴别卵巢肿瘤良/恶性的方法，包括步骤：

38、(a)根据训练队列mirna表达量数据，结合病理检测结果，构建良/恶性分类模型；

39、(b)以待测对象mirna表达量为变量，结合参比值，当风险值小于或等于参比值时则判定该对象为良性，否则为恶性卵巢癌；

40、所述的mirna是：

41、(i)序列如seq id no:1所示的mirna；或者

42、(ii)与(i)所述mirna序列互补的mirna。。

43、在优选的实施方式中，所述参比值为5.75。

44、在优选的实施方式中，所述的mirna是分离自人的mirna。

45、在优选的实施方式中，所述的mirna是血液胞外囊泡mirna。

46、在第七方面，本发明提供一种分离自血液胞外囊泡的mirna，所述的mirna是：

47、(i)序列如seq id no:1所示的mirna；或者

48、(ii)与(i)所述mirna序列互补的mirna。

49、在优选的实施方式中，所述的mirna是分离自人的mirna。

50、在优选的实施方式中，所述的mirna是血液胞外囊泡mirna。

51、在第八方面，本发明提供一种分离的或人工构建的前体mirna，所述的前体mirna能在人细胞内剪切并表达成所述的mirna。

52、在第九方面，本发明提供一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸能被人细胞转录成前体mirna，所述的前体mirna能在人细胞内被剪切且表达成所述的mirna。

53、在优选的实施方式中，所述的多核苷酸具有式i所示的结构：

54、seq正向-x-seq反向  式i

55、式i中，

56、seq正向为能在人细胞中表达成所述的mirna的核苷酸序列；

57、seq反向为与seq正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；

58、x为位于seq正向和seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与seq正向和seq反向不互补；

59、式i所示的结构在转入人细胞后，形成式ii所示的二级结构：

60、

61、式ii中，seq正向、seq反向和x的定义如上述，

62、||表示在seq正向和seq反向之间形成的碱基互补配对关系。

63、在第十方面，本发明提供一种载体，所述载体含有所述的mirna或所述的多核苷酸。

64、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。