血液小型胞外囊泡miRNA在卵巢癌诊断中的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域。具体地说，本发明涉及用于诊断卵巢癌的血液小型胞外囊泡mirna的组合及其应用。

背景技术：

1、卵巢癌(ovarian cancer，oc)是女性生殖系统三大肿瘤之一。尽管卵巢癌的发病率相对较低，但病死率位居妇科肿瘤之首，已成为严重威胁女性健康的恶性疾病之一。早期(i期和ii期)卵巢癌患者的五年生存率为80～95％，而晚期(包括iii期和iv期)卵巢癌患者的五年生存率只有10～30％。卵巢位于盆腔深部，早期阶段的卵巢癌由于缺乏特异性的症状，使得早期病变不易发现，超过2/3的卵巢癌患者在诊断时已进展到晚期。若能早期发现，施以肿瘤细胞减灭术并辅以铂类为主的联合化疗，卵巢癌的5年生存率能提高到40％～50％。

2、卵巢癌的诊断方法主要有影像学检查，肿瘤标志物测定，细胞学和组织病理学检查。由于卵巢完全是腹膜内器官，不进行手术而诊断出卵巢癌是不可能的。目前，组织病理学活检是确诊卵巢癌的金标准。从可疑区域取组织样本在显微镜下观察，是对卵巢癌进行确诊的唯一方法。但是对于早期卵巢肿瘤应避免穿刺活检，因为癌细胞容易扩散到腹膜腔，穿刺可促进腹膜转移。因而穿刺活检适用于因癌症晚期或者其他严重疾病不适宜进行手术的患者。对于腹部有积液的患者，可以取腹部积液进行分析看其中是否存在癌细胞。

3、目前，卵巢癌的各种检查手段各有利弊，确诊还要结合病史，综合评估。因此，卵巢癌的诊断迫切需要一种低侵入性的诊断生物标志物，以实现对卵巢癌的早期发现和诊断，并探索用于筛查试验的可能性。

技术实现思路

1、本发明旨在通过发现和验证高准确性的血液小型胞外囊泡mirna诊断生物标志物模型，开发可以用于卵巢癌诊断的独立液体活检技术，以弥补现有影像学检查，血清肿瘤标志物测定和组织活检在卵巢癌诊断上的不足，为临床提供侵入性低的诊断技术，减少患者的痛苦，提高患者的生活质量。

2、为此，本发明提供了一种生物标志物的组合，这种组合能够在临床上诊断卵巢癌，尤其是区分卵巢肿瘤良恶性。

3、本发明还提供了能够在临床上诊断卵巢癌，尤其是区分卵巢肿瘤良恶性的芯片和试剂盒。

4、本发明还提供了利用所述生物标志物来诊断卵巢癌，尤其是区分卵巢肿瘤良恶性的方法。

5、在第一方面，本发明提供血液小型胞外囊泡mirna在制备用于诊断卵巢癌的芯片、检测试剂或检测试剂盒中的用途，其中所述mirna是

6、(i)选自下组的一个或多个mirna：hsa-mir-1-3p、hsa-mir-106a-5p、hsa-mir-130a-3p、hsa-mir-196b-5p、hsa-mir-199a-3p、hsa-mir-199b-3p、hsa-mir-200c-3p、hsa-mir-21-5p、hsa-mir-335-5p、hsa-mir-340-5p、hsa-mir-374a-5p、hsa-mir-374b-5p、hsa-mir-542-3p和hsa-mir-96-5p；或者

7、(ii)与(i)所述mirna序列互补的mirna。

8、在优选的实施方式中，所述“多个”是2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个或14个。

9、在具体的实施方式中，所述的诊断卵巢癌是卵巢癌的早期诊断；优选地，所述卵巢癌的早期诊断是区分卵巢肿瘤良恶性。

10、在具体的实施方式中，所述mirna是选自下组的一个或多个mirna：hsa-mir-1-3p、hsa-mir-106a-5p、hsa-mir-130a-3p、hsa-mir-200c-3p、hsa-mir-21-5p、hsa-mir-335-5p、hsa-mir-340-5p和hsa-mir-542-3p。

11、在优选的实施方式中，所述“多个”是2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个。

12、在第二方面，本发明提供一种mirna芯片，所述的mirna芯片包括：

13、固相载体；以及

14、有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地结合mirna；

15、其中，所述的mirna是第一方面所述的mirna。

16、在具体的实施方式中，所述的寡核苷酸探针含有：

17、互补结合区；和/或

18、与固相载体相连的连接区。

19、在具体的实施方式中，所述mirna芯片用于卵巢癌的早期诊断；优选区分卵巢肿瘤良恶性。

20、在优选的实施方式中，所述的mirna是血液小型胞外囊泡mirna。

21、在第三方面，本发明提供第二方面所述的mirna芯片的用途，用于制备诊断卵巢癌的检测试剂盒。

22、在具体的实施方式中，所述诊断卵巢癌是卵巢癌的早期诊断；优选地，所述卵巢癌的早期诊断是区分卵巢肿瘤良恶性。

23、在第四方面，本发明提供一种检测试剂盒，所述的检测试剂盒装有检测mirna的检测试剂；

24、其中，所述的mirna是第一方面所述的mirna；

25、或者，所述检测试剂盒装有第二方面所述的mirna芯片。

26、在具体的实施方式中，所述检测试剂盒用于卵巢癌的早期诊断；优选用于区分卵巢肿瘤良恶性。

27、在优选的实施方式中，所述的mirna是血液小型胞外囊泡mirna。

28、在第五方面，本发明提供一种分离自血液小型胞外囊泡的mirna，用于卵巢癌的诊断：

29、其中，所述的mirna是：

30、(i)选自下组的一个或多个mirna：hsa-mir-1-3p、hsa-mir-106a-5p、hsa-mir-130a-3p、hsa-mir-196b-5p、hsa-mir-199a-3p、hsa-mir-199b-3p、hsa-mir-200c-3p、hsa-mir-21-5p、hsa-mir-335-5p、hsa-mir-340-5p、hsa-mir-374a-5p、hsa-mir-374b-5p、hsa-mir-542-3p和hsa-mir-96-5p；或者

31、(ii)与(i)所述mirna序列互补的mirna。

32、在优选的实施方式中，所述“多个”是2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个或14个。

33、在优选的实施方式中，所述的诊断卵巢癌是卵巢癌的早期诊断；优选地，所述卵巢癌的早期诊断是区分卵巢肿瘤良恶性。

34、在优选的实施方式中，所述mirna是选自下组的一个或多个mirna：hsa-mir-1-3p、hsa-mir-106a-5p、hsa-mir-130a-3p、hsa-mir-200c-3p、hsa-mir-21-5p、hsa-mir-335-5p、hsa-mir-340-5p和hsa-mir-542-3p。

35、在优选的实施方式中，所述“多个”是2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个。

36、在优选的实施方式中，所述的卵巢癌的诊断是卵巢癌的早期诊断；优选是区分卵巢良性肿瘤和恶性肿瘤。

37、在优选的实施方式中，所述的mirna是血液小型胞外囊泡mirna。

38、在第六方面，本发明提供一种卵巢癌的诊断的方法，包括步骤：

39、(a)根据训练队列mirna表达量数据，结合病理检测结果，构建良/恶性分类模型；

40、(b)以待测对象mirna表达量为变量，结合参比值，当风险值小于或等于参比值时则判定该对象为良性，否则为恶性卵巢癌；

41、所述的mirna是：

42、(i)选自下组的一个或多个mirna：hsa-mir-1-3p、hsa-mir-106a-5p、hsa-mir-130a-3p、hsa-mir-196b-5p、hsa-mir-199a-3p、hsa-mir-199b-3p、hsa-mir-200c-3p、hsa-mir-21-5p、hsa-mir-335-5p、hsa-mir-340-5p、hsa-mir-374a-5p、hsa-mir-374b-5p、hsa-mir-542-3p和hsa-mir-96-5p；或者

43、(ii)与(i)所述mirna序列互补的mirna。

44、在优选的实施方式中，所述“多个”是2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个或14个。

45、在优选的实施方式中，所述的诊断卵巢癌是卵巢癌的早期诊断；优选地，所述卵巢癌的早期诊断是区分卵巢肿瘤良恶性。

46、在优选的实施方式中，所述mirna是选自下组的一个或多个mirna：hsa-mir-1-3p、hsa-mir-106a-5p、hsa-mir-130a-3p、hsa-mir-200c-3p、hsa-mir-21-5p、hsa-mir-335-5p、hsa-mir-340-5p和hsa-mir-542-3p。

47、在优选的实施方式中，所述“多个”是2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个。

48、在优选的实施方式中，所述参比值为0.562。

49、在优选的实施方式中，所述的卵巢癌的诊断是卵巢癌的早期诊断；优选是区分卵巢肿瘤良恶性，其中，所述对照样本是卵巢良性病变样本。

50、在优选的实施方式中，所述的mirna是血液小型胞外囊泡mirna。

51、在第七方面，本发明提供一种分离自血液小型胞外囊泡的mirna，所述的mirna是：

52、(i)选自下组的一个或多个mirna：hsa-mir-1-3p、hsa-mir-106a-5p、hsa-mir-130a-3p、hsa-mir-196b-5p、hsa-mir-199a-3p、hsa-mir-199b-3p、hsa-mir-200c-3p、hsa-mir-21-5p、hsa-mir-335-5p、hsa-mir-340-5p、hsa-mir-374a-5p、hsa-mir-374b-5p、hsa-mir-542-3p和hsa-mir-96-5p；或者

53、(ii)与(i)所述mirna序列互补的mirna。

54、在优选的实施方式中，所述“多个”是2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个或14个。

55、在优选的实施方式中，所述mirna是选自下组的一个或多个mirna：hsa-mir-1-3p、hsa-mir-106a-5p、hsa-mir-130a-3p、hsa-mir-200c-3p、hsa-mir-21-5p、hsa-mir-335-5p、hsa-mir-340-5p和hsa-mir-542-3p。

56、在优选的实施方式中，所述“多个”是2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个。

57、在第八方面，本发明提供一种分离的或人工构建的前体mirna，所述的前体mirna能在人细胞内剪切并表达成所述的mirna。

58、在第九方面，本发明提供一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸能被人细胞转录成前体mirna，所述的前体mirna能在人细胞内被剪切且表达成所述的mirna。

59、在优选的实施方式中，所述的多核苷酸具有式i所示的结构：

60、seq正向-x-seq反向  式i

61、式i中，

62、seq正向为能在人细胞中表达成所述的mirna的核苷酸序列；

63、seq反向为与seq正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；

64、x为位于seq正向和seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与seq正向和seq反向不互补；

65、式i所示的结构在转入人细胞后，形成式ii所示的二级结构：

66、

67、式ii中，seq正向、seq反向和x的定义如上述，

68、||表示在seq正向和seq反向之间形成的碱基互补配对关系。

69、在第十方面，本发明提供一种载体，所述载体含有所述的mirna或所述的多核苷酸。

70、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。