一种厌氧硫酸酯酶成熟酶基因、厌氧硫酸酯酶成熟酶及其制备方法和应用

本发明属于基因工程，尤其涉及一种厌氧硫酸酯酶成熟酶基因、厌氧硫酸酯酶成熟酶及其制备方法和应用。

背景技术：

1、细菌硫酸酯酶通常起到清除剂的作用，其可以从外源底物中去除硫酸盐基团，为细菌的生长繁殖提供硫和碳源，在细菌的定植和致病过程中有着至关重要的作用，例如在溃疡性结肠炎(uc)患者的粪便提取物中检测到粘蛋白硫酸酯酶活性增加，铜绿假单胞菌硫酸酯酶(atsa)可以促进其在肠道的定植。

2、细菌硫酸酯酶需要将关键活性位点半胱氨酰或丝氨酰残基进行必要的翻译后修饰，使其变为通常称为cα-甲酰甘氨酸(fgly)才能发挥水解活性，进而从广泛的反应底物中去除硫酸基团，为细菌提供营养物质，如利用硫酸化多糖和结肠粘蛋白。这种翻译后修饰由厌氧硫酸酯酶成熟酶(ansme)进行厌氧催化，该酶是自由基adomet超家族的成员。很多机会致病菌如产气荚膜梭菌atcc 13124，铜绿假单胞菌，肺炎克雷伯菌，多形拟杆菌等均携带硫酸酯酶及其成熟酶基因。goldmanpj等人(goldman pj,grove tl,sites la,mclaughlinmi,booker sj,drennan cl.x-ray structure of an adomet radical activase revealsan anaerobic solution for formylglycine posttranslational modification.procnatlacad sci u s a.2013may 21；110(21):8519-24.)表征了产气荚膜梭菌atcc 13124的厌氧硫酸酯酶成熟酶并验证了其具有修饰硫酸酯酶的活性特征；hickey ca等人(hickeyca,kuhn ka,donermeyer dl,porternt,jin c,cameron ea,jung h,kaiko ge,wegorzewska m,malvin np,glowacki rw,hansson gc,allen pm,martens ec,stappenbeck ts.colitogenic bacteroides thetaiotaomicronantigens access hostimmune cells in a sulfatase-dependent manner via outer membrane vesicles.cellhost microbe.2015may 13；17(5):672-80.)证明了厌氧硫酸酯酶成熟酶基因是多形拟杆菌引发小鼠结肠炎所必须的，当敲除了厌氧硫酸酯酶成熟酶基因，多形拟杆菌不会引发小鼠结肠炎症。所以厌氧硫酸酯酶成熟酶ansme是一种新的炎症性肠道疾病的药物靶点，该酶的研究对于肠道疾病的预防和治疗有重要的意义。但迄今为止国内尚未有相关厌氧硫酸酯酶成熟酶ansme的研究报道。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种厌氧硫酸酯酶成熟酶基因、厌氧硫酸酯酶成熟酶及其制备方法和应用，本发明提供的厌氧硫酸酯酶成熟酶对硫酸酯酶具有修饰活性。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

3、本发明提供了一种厌氧硫酸酯酶成熟酶基因，所述厌氧硫酸酯酶成熟酶基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

4、本发明还提供了上述技术方案所述的厌氧硫酸酯酶成熟酶基因在修饰硫酸酯酶中的应用。

5、本发明还提供了一种由上述技术方案所述的厌氧硫酸酯酶成熟酶基因编码的厌氧硫酸酯酶成熟酶，所述厌氧硫酸酯酶成熟酶的氨基酸序列如seq id no.2所示。

6、本发明还提供了上述技术方案所述的厌氧硫酸酯酶成熟酶在修饰硫酸酯酶中的应用。

7、本发明还提供了一种上述技术方案所述厌氧硫酸酯酶成熟酶的制备方法，包括以下步骤：

8、1)将上述技术方案所述的厌氧硫酸酯酶成熟酶基因插入到表达载体中，得到重组表达载体；

9、2)将所述步骤2)得到的重组表达载体转化到大肠杆菌中进行发酵培养，得到发酵液；

10、3)将所述步骤2)得到的发酵液在7000g、4℃下离心10min，收集菌体，将所述菌体经细胞裂解缓冲液裂解在13000g、4℃下离心20min，收集沉淀；

11、4)将所述步骤3)得到的沉淀经包涵体溶解液重悬在13000g、4℃下离心20min，得到上清液，将所述上清液与稀释复性液混合，得到复性蛋白溶液；

12、5)将所述步骤4)得到的复性蛋白溶液经镍柱纯化，得到厌氧硫酸酯酶成熟酶。

13、优选的，所述步骤1)表达载体包括pet-28a，所述表达载体经过bamhi和hindiii限制性内切酶酶切。

14、优选的，所述步骤2)发酵培养使用的培养基为含有50μg/ml硫酸卡那霉素的lb培养基；

15、所述发酵培养的条件包括：温度为37℃，200rpm摇床培养至od600＝0.6-0.8时，再加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷至终浓度为100μmol/l，16℃，160rpm诱导20h。

16、优选的，所述步骤3)细胞裂解缓冲液包括：50mmol/l tris-base、150mmol/lkcl、体积百分含量为10％甘油、1mmol/l dtt，ph值为7.5。

17、优选的，所述步骤4)包涵体溶解液包括：8mol/l尿素、1mol/lkcl、10mmol/ltris-base，ph值为7.5。

18、优选的，所述步骤4)稀释复性液包括：50mmol/l tris-base、1mol/l nacl、2mol/l尿素、100mmol/l甘氨酸、1mmol/l还原型谷胱甘肽、1mmol/l edta，ph值为7.5。

19、本发明的有益效果为：

20、本发明提供的厌氧硫酸酯酶成熟酶基因能在大肠杆菌中大量表达，经纯化后可获得大量可溶性的厌氧硫酸酯酶成熟酶，并且仍具有较好的硫酸酯酶修饰活性，克服了厌氧硫酸酯酶成熟酶难以大量纯化获取的问题，可以广泛应用于硫酸酯酶及相关的疾病研究。

技术特征：

1.一种厌氧硫酸酯酶成熟酶基因，其特征在于，所述厌氧硫酸酯酶成熟酶基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

2.权利要求1所述的厌氧硫酸酯酶成熟酶基因在修饰硫酸酯酶中的应用。

3.一种由权利要求1所述的厌氧硫酸酯酶成熟酶基因编码的厌氧硫酸酯酶成熟酶，其特征在于，所述厌氧硫酸酯酶成熟酶的氨基酸序列如seq id no.2所示。

4.权利要求3所述的厌氧硫酸酯酶成熟酶在修饰硫酸酯酶中的应用。

5.一种权利要求3所述厌氧硫酸酯酶成熟酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)表达载体包括pet-28a，所述表达载体经过bamhi和hindiii限制性内切酶酶切。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)发酵培养使用的培养基为含有50μg/ml硫酸卡那霉素的lb培养基；

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)细胞裂解缓冲液包括：50mmol/ltris-base、150mmol/lkcl、体积百分含量为10％甘油、1mmol/l dtt，ph值为7.5。

9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4)包涵体溶解液包括：8mol/l尿素、1mol/lkcl、10mmol/ltris-base，ph值为7.5。

10.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4)稀释复性液包括：50mmol/ltris-base、1mol/lnacl、2mol/l尿素、100mmol/l甘氨酸、1mmol/l还原型谷胱甘肽、1mmol/l edta，ph值为7.5。

技术总结
本发明提供了一种厌氧硫酸酯酶成熟酶基因、厌氧硫酸酯酶成熟酶及其制备方法和应用，属于基因工程技术领域。所述厌氧硫酸酯酶成熟酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明提供的厌氧硫酸酯酶成熟酶对硫酸酯酶具有修饰活性。

技术研发人员：杨勇军,王涛,陈巍,刘真真
受保护的技术使用者：吉林大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12