1.本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种绿色木霉菌的发酵培养基、木霉菌剂及其制备方法。
背景技术：
2.有益微生物也被称为拮抗微生物,或者简称生防菌,生物防治中生防菌通过对病原菌产生各种不利的影响,来减少病原菌的数量,削弱病原菌的致病力。生防菌种类繁多,且有些已被制成多种类型的生防制剂,用于田间病害防治。目前，真菌、细菌、放线菌等作为重要的生防菌，已被广泛应用于生物防治中。
3.木霉菌是发现的较早、研究得最深入的生防真菌,是土壤中资源丰富的生防真菌之一，能够防治田间多种引起土传病害的病原菌,具有极高的生防价值。大量研究发现,木霉菌能够产生促进某些植物生长的代谢物质,可提高植物的营养利用率,在提高植物抗逆性和改善农业化学污染环境等方面也凸显出了显著优势。木霉菌无论是对植物的促生作用，还是对病原菌的防治作用，都是安全、环保、有效的,可以解决农药污染问题,为人类提供无污染、无公害绿色食品,促进生态环境平衡和农业的可持续发展。
4.节水灌溉可有效地利用降水和灌溉水而采取的灌溉措施。滴灌目前在我国应用较广，发展较快，适用于蔬菜、果树、花卉及垄向种植的作物，经济效益十分显著。
5.然而，传统的绿色木霉固体发酵工艺，发酵原料以玉米芯和麸皮为主，发酵周期较长，有效活菌数较低，且曲料中含有大量的纤维素物质，孢子不易分离，分离出的孢子粉含有大量纤维素类颗粒，易堵塞滴灌管，不能喷、滴灌施用。因此，急需提供一种活菌数高、悬浮性好的绿色木霉菌剂，将其广泛地用于喷灌、滴灌等节水设施。
技术实现要素：
6.有鉴于此，本发明提供了活菌数高、悬浮性好的绿色木霉菌剂及其制备方法。
7.本发明提供一种绿色木霉菌的发酵培养基，包括液体发酵培养基和固体发酵培养基；
8.所述液体发酵培养基由玉米浆、酵母粉、豆饼粉、玉米粉、葡萄糖和硫酸组成；
9.所述液体发酵培养基由小米、水、葡萄糖、酵母粉、硫酸铵、硫酸镁、碳酸钙、苏叶粉、生地榆和麦冬组成。
10.一些实施方案中，所述液体培养基由水和以下质量百分数的原料组成：
11.玉米浆1.5-2.5％，酵母粉0.5-1.0％，豆饼粉0.5-1.0％，玉米粉1.5-2.5％，葡萄糖0.5-1.5％，硫酸镁0.1-0.2％；
12.各原料总和为100％；
13.所述固体培养基由以下重量份的原料组成：
14.小米100份，水40-80份，葡萄糖1.0-5.0份，酵母粉0.5-2.0份，硫酸铵0.5-1.5份，硫酸镁0.2-0.8份，碳酸钙0.5-1.0份，苏叶粉5-10份，生地榆2-5份，麦冬1-2份。
15.一些具体实施例中，所述发酵培养基中，液体培养基和固体培养基的组成如下之一：
16.(1)液体培养基由水和以下质量百分数的原料组成：
17.玉米浆1.5％，酵母粉1.0％，豆饼粉1.0％，玉米粉2.5％，葡萄糖0.5％，硫酸镁0.1％；
18.各原料总和为100％；
19.固体培养基由以下重量份的原料组成：
20.小米100份，水80份，葡萄糖5.0份，酵母粉2.0份，硫酸铵1.5份，硫酸镁0.8份，碳酸钙1.0份，苏叶粉5份，生地榆2份，麦冬1份。
21.(2)液体培养基由水和以下质量百分数的原料组成：
22.玉米浆1.5％，酵母粉1.0％，豆饼粉1.0％，玉米粉2.5％，葡萄糖0.5％，硫酸镁0.1％；
23.各原料总和为100％；
24.固体培养基由以下重量份的原料组成：
25.小米100份；水50份；葡萄糖3.0份；酵母粉1.5份；硫酸铵1.0份；硫酸镁0.5份；碳酸钙0.75份；苏叶粉10份；生地榆2份；麦冬2份。
26.(3)液体培养基由水和以下质量百分数的原料组成：
27.玉米浆1.5％，酵母粉1.0％，豆饼粉1.0％，玉米粉2.5％，葡萄糖0.5％，硫酸镁0.1％；
28.各原料总和为100％；
29.固体培养基由以下重量份的原料组成：
30.小米100份；水60份；葡萄糖4.0份；酵母粉1.6份；硫酸铵1.2份；硫酸镁0.6份；碳酸钙0.8份；苏叶粉8份；生地榆3份；麦冬1.5份。
31.(4)液体培养基由水和以下质量百分数的原料组成：
32.玉米浆1.5％，酵母粉1.0％，豆饼粉1.0％，玉米粉2.5％，葡萄糖0.5％，硫酸镁0.1％；
33.各原料总和为100％；
34.固体培养基由以下重量份的原料组成：
35.小米100份；水40份；葡萄糖1.0份；酵母粉0.5-2.0份；硫酸铵0.5份；硫酸镁0.2份；碳酸钙0.5份；苏叶粉6份；生地榆4份。
36.本发明提供一种绿色木霉分生孢子粉，由本发明以上所述的发酵培养基中的液体发酵培养基和固体培养基发酵绿色木霉菌制得。
37.本发明对绿色木霉菌的来源没有特殊限定，为本领域常见的绿色木霉菌即可。本发明具体实施例中，采用保藏编号为cgmcc no.5044的绿色木霉菌。
38.本发明还提供了所述绿色木霉分生孢子粉的制备方法，包括：
39.步骤1：将绿色木霉菌接种本发明所述的发酵培养基中的液体发酵培养基进行液体发酵，获得液体发酵液；
40.步骤2：将所述液体发酵液作为种子液接种至所述固体发酵培养基中进行曲盘发酵，干燥、过筛。
41.一些实施方案中，所述液体发酵的接种量1～8％，具体可为1％、5％或8％；所述液体发酵的温度为28-32℃，压力为0.03-0.05mpa，搅拌转速100-160转/分，通风量0.8-1.2v/v
·
min，时间为24-36小时。
42.一些具体实施例中，所述液体发酵的温度为30℃，压力为0.04mpa，搅拌转速100-160转/分，通风量1v/v
·
min，时间为30小时。
43.一些实施方案中，所述曲盘发酵的接种量5％～20％，具体可为5％、8％、12％或20％；所述曲盘发酵的温度为28℃-32℃，湿度为70-90％，时间为48-72小时。
44.一些具体实施例中，所述曲盘发酵具体为如下之一：
45.(1)湿度为70％、温度为28℃的条件下发酵24h，待培养基长满白色菌丝翻曲一次；发酵培养基布满绿色孢子，发酵结束。
46.(2)在湿度为80％、温度为28℃的条件下发酵12小时，然后在湿度为80％、温度为32℃的条件下培养24小时，待培养基长满白色菌丝翻曲一次；发酵培养基布满绿色孢子，发酵结束。
47.(3)温度为28℃的条件下发酵24小时；然后在湿度为85％、温度为30℃的条件下发酵24小时；再在湿度为85％、温度为30℃的条件下发酵24小时，待培养基长满白色菌丝翻曲一次；发酵培养基布满绿色孢子，发酵结束。
48.(4)湿度为90％、温度为32℃的条件下培养24h,待培养基长满白色菌丝翻曲一次；发酵培养基布满绿色孢子，发酵结束。
49.本发明中，所述曲盘发酵的过程中还包括翻曲步骤。在培养基长满白色菌丝时进行翻曲，所述翻曲的次数为1次。
50.本发明还提供一种绿色木霉菌剂，包括本发明所述的绿色木霉分生孢子粉以及农药学上可接受的辅料。
51.本领域技术人员可选择制备不同剂型所需的辅料，如湿润剂、分散剂、渗透剂、防冻剂、增稠剂、增效剂、填料中的一种或多种，将本发明绿色木霉分生孢子粉按照本领域常规的制备方法制成不同的剂型，如可湿性粉剂、水分散粒剂、悬浮剂或悬乳剂等等。
52.本发明采用液固联合发酵，以小米为主要原料固态发酵，辅以速效碳氮源及无机盐，相比传统工艺，本发明通过特定发酵培养基和发酵工艺发酵制得的绿色木霉分生孢子粉的活菌数和悬浮性相明显得到提高。将本发明制得的绿色木霉分生孢子粉与润湿剂、分散剂和载体等混合后制备绿色木霉可湿性粉剂，制剂水溶性好，可用于农作物喷滴灌使用，可以防治植物病害，同时具有安全高效，无药残，无毒副作用，减少抗生素药物的使用，提高作物免疫力的优点。
具体实施方式
53.本发明提供了一种绿色木霉菌的发酵培养基、木霉菌剂及其制备方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
54.本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
55.下面结合实施例，进一步阐述本发明：
56.实施例1
57.将绿色木霉菌株经培养后制成浓度为5
×
108cfu/ml的孢子悬液；孢子悬液接种至液体发酵培养基进行发酵，液体发酵培养基包括如下组分：玉米浆1.5％，酵母粉1.0％，豆饼粉1.0％，玉米粉2.5％，葡萄糖0.5％，硫酸镁0.1％，ph值自然，121℃灭菌30分钟。
58.接种量5％，发酵温度为28-32℃，压力为0.03-0.05mpa，搅拌转速100-160转/分，通风量0.8-1.2v/v
·
min，培养24-36小时，制备液体种子。
59.将液体种子液接种至固体发酵培养基进行曲盘发酵，固体发酵培养基包括如下单位重量份的组分组成：小米100；水80；葡萄糖5.0；酵母粉2.0；硫酸铵1.5；硫酸镁0.8；碳酸钙1.0；苏叶粉5；生地榆2；麦冬1。121℃灭菌60分钟，每隔5分钟翻动1次，每次1分钟。
60.每盘培养基装量2公斤，厚度3厘米，接种量5％，发酵温度为28℃，湿度为70％，培养24小时；培养基长满白色菌丝，翻曲一次。培养72小时，发酵培养基布满绿色孢子，发酵结束，干燥后100目筛网筛分得孢子粉有效活菌数332亿/克。
61.实施例2
62.将绿色木霉菌株经培养后制成浓度为5
×
108cfu/ml的孢子悬液；孢子悬液接种至液体发酵培养基进行发酵，液体发酵培养基包括如下组分：玉米浆1.5％，酵母粉1.0％，豆饼粉1.0％，玉米粉2.5％，葡萄糖0.5％，硫酸镁0.1％，ph值自然，121℃灭菌30分钟。
63.接种量5％，发酵温度为28-32℃，压力为0.03-0.05mpa，搅拌转速100-160转/分，通风量0.8-1.2v/v
·
min，培养24-36小时，制备液体种子。
64.将液体种子液接种至固体发酵培养基进行发酵，固体发酵培养基包括如下单位重量份的组分组成：小米100；水50；葡萄糖3.0；酵母粉1.5；硫酸铵1.0；硫酸镁0.5；碳酸钙0.75；苏叶粉10；生地榆2；麦冬2。121℃灭菌60分钟，每隔5分钟翻动1次，每次1分钟。
65.每盘培养基装量2.5公斤，厚度4厘米，接种量8％，发酵温度为0-12小时28℃，12小时后32℃，湿度为80％，培养24小时；培养基长满白色菌丝，翻曲一次。培养60小时，发酵培养基布满绿色孢子，发酵结束，干燥后100目筛网筛分得孢子粉有效活菌数465亿/克。
66.实施例3
67.将绿色木霉菌株经培养后制成浓度为5
×
108cfu/ml的孢子悬液；孢子悬液接种至液体发酵培养基进行发酵，液体发酵培养基包括如下组分：玉米浆1.5％，酵母粉1.0％，豆饼粉1.0％，玉米粉2.5％，葡萄糖0.5％，硫酸镁0.1％，ph值自然，121℃灭菌30分钟。
68.接种量5％，发酵温度为28-32℃，压力为0.03-0.05mpa，搅拌转速100-160转/分，通风量0.8-1.2v/v
·
min，培养24-36小时，制备液体种子。
69.将液体种子液接种至固体发酵培养基进行发酵，固体发酵培养基包括如下单位重量份的组分组成：小米100；水60；葡萄糖4.0；酵母粉1.6；硫酸铵1.2；硫酸镁0.6；碳酸钙0.8；苏叶粉8；生地榆3；麦冬1.5。121℃灭菌60分钟，每隔5分钟翻动1次，每次1分钟。
70.每盘培养基装量2.0公斤，厚度3厘米，接种量12％，发酵温度为0-24小时28℃；24小时后30℃，湿度为85％，培养24小时；培养基长满白色菌丝，翻曲一次。培养72小时，发酵培养基布满绿色孢子，发酵结束，干燥后100目筛网筛分得孢子粉有效活菌数432亿/克。
71.实施例4
72.将绿色木霉菌株经培养后制成浓度为5
×
108cfu/ml的孢子悬液；孢子悬液接种至
液体发酵培养基进行发酵，液体发酵培养基包括如下组分：玉米浆1.5％，酵母粉1.0％，豆饼粉1.0％，玉米粉2.5％，葡萄糖0.5％，硫酸镁0.1％，ph值自然，121℃灭菌30分钟。
73.接种量5％，发酵温度为28-32℃，压力为0.03-0.05mpa，搅拌转速100-160转/分，通风量0.8-1.2v/v
·
min，培养24-36小时，制备液体种子。
74.将液体种子液接种至固体发酵培养基进行发酵，固体发酵培养基包括如下单位重量份的组分组成：小米100；水40；葡萄糖1.0；酵母粉0.5-2.0；硫酸铵0.5；硫酸镁0.2；碳酸钙0.5；苏叶粉6；生地榆4；麦冬2。121℃灭菌60分钟，每隔5分钟翻动1次，每次1分钟。
75.每盘培养基装量3公斤，厚度5厘米，接种量20％，发酵温度为32℃，湿度为90％；在培养24h时，培养基长满白色菌丝，翻曲一次。培养48小时发酵培养基布满绿色孢子时，发酵结束，干燥后100目筛网筛分得孢子粉有效活菌数394亿/克。
76.实施例5
77.将实施例4制备的绿色木霉孢子粉15份加入混合机中，再依次加入十二烷基硫酸钠5份、木质素磺酸钠4份、变性淀粉60份和滑石粉16份，混合0.5～1h后得到均匀的混合物，即制得分散性和悬浮性良好的可湿性粉剂。可湿性粉剂的悬浮率为75％，润湿时间为84s。
78.实施例6
79.将实施例1制备的绿色木霉孢子粉20份加入混合机中，再依次加入十二烷基硫酸钠8份、木质素磺酸钠6份、变性淀粉50份和滑石粉16份，混合0.5～1h后得到均匀的混合物，即制得分散性和悬浮性良好的可湿性粉剂。可湿性粉剂的悬浮率为86％，润湿时间为76s。
80.以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。