一种粪便肠道脱落细胞核酸提取用试剂盒及核酸提取方法与流程

1.本发明涉及一种粪便肠道脱落细胞核酸提取用试剂盒及核酸提取方法，属于分子生物学领域。


背景技术：

2.粪便自肠道形成，在排出体外的过程中会带有很多肠道脱落细胞，正常人每克粪便样本中存在约106肠道脱落细胞，而结直肠癌患者其脱落细胞更多。因此对粪便进行肠道脱落细胞dna提取，提取得到的dna进行相关marker的检测可预示人体健康状况，如是否有患结直肠癌的风险。dna检测方法很多，但是检测的准确度与粪便的采集及提取方法息息相关。从粪便中有效提取dna是进行下游检测的基础，只有得到高质量的粪便肠道脱落细胞dna才能确保后续的检测实验。但是粪便成分复杂，里面除了含有肠道脱落细胞外，还有腐殖酸、微生物、蛋白质、无机盐、脂肪及未消化的食物纤维，从如此复杂的成分里提取得到肠道脱落细胞dna并不容易。
3.目前市场上常用粪便脱落细胞核酸试剂盒和提取方法，提取得到的dna质量参差不齐，其中一些组分偏粘稠在操作的过程中，极易黏附于枪头上。而且把dna从磁珠洗脱的过程中，不易洗脱。提取组分偏粘稠造成在提取过程中大大拉长提取时间，不易实现自动化提取。因为这样的组分会造成，最后一步洗脱dna的时候，会有大量磁珠残留，影响后续实验。


技术实现要素：

4.为了解决上述问题，本发明提供了一种粪便肠道脱落细胞核酸提取用试剂盒，使用该试剂盒可以简单、快速地从粪便中提取肠道脱落细胞的dna。
5.本发明还提供了使用该粪便肠道脱落细胞核酸提取用试剂盒的核酸提取方法，操作简便，节省时间，对粪便粪便肠道脱落细胞核酸自动化提取流程的研发具有重要意义。
6.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
7.一种粪便肠道脱落细胞核酸提取用试剂盒，包括以下成分：粪便保存液、裂解液、洗涤液1、洗涤液2和磁珠；粪便保存液包括如下工作浓度的组分：1-5m硫氰酸胍、0.05-0.1m tris-hcl、0.15m nacl、2-10mm edta、0.1-1％ tritonx-100、0.1％-1％ tween-20。
8.该粪便肠道脱落细胞核酸提取用试剂盒在保证提取得到的dna质量的同时，对一些组分进行了调整，提取流程中各组分都不粘稠，这样就保证了实验流程的顺畅，不会出现溶液黏附于枪头，不易吹打的现象。在进行人工提取时，便于操作，节约时间。
9.优选地，所述的粪便保存液的ph为7.5
±
0.5。
10.优选地，所述的裂解液包括如下工作浓度的组分：5％-10％ sds、2-4mm edta。
11.进一步优选地，所述的裂解液的ph为7.50
±
0.50。
12.优选地，所述的洗涤液1包括如下工作浓度的组分：60％-80％(v/v)乙醇、0.05m tris-hcl、0.15m nacl。
13.具体地，60％-80％(v/v)乙醇可以在使用前加入。
14.优选地，所述的洗涤液2包括如下工作浓度的组分：0.05-0.1m tris-hcl、60-70％(v/v)乙醇。
15.具体地，60-70％(v/v)乙醇可以在使用前加入。
16.一种采用粪便肠道脱落细胞核酸提取用试剂盒的核酸提取方法，具体操作步骤如下：
17.步骤1)粪便样本保存在粪便保存液中，离心取上清于洁净离心管中；
18.步骤2)向上清液中加入裂解液、磁珠，混匀后70-90℃孵育8～12min；
19.步骤3)将离心管震荡混匀，冷却至室温后，置于磁力架上吸附1～2min，弃去上清；
20.步骤4)向离心管中加入洗涤液1，混匀后置于磁力架上吸附1～2min，弃去上清；
21.步骤5)向离心管中加入洗涤液2，混匀后置于磁力架上吸附1～2min，弃去上清；
22.步骤6)重复步骤5)；
23.步骤7)向离心管中加入无水乙醇，将磁珠-乙醇混合物转移至新的洁净离心管中，置于磁力架上吸附1～2min，弃去上清；
24.步骤8)室温干燥数分钟，加入h2o震荡洗脱；
25.步骤9)将离心管置于磁力架上吸附1～2min，将上清液转移至新的离心管中，此上清即为提取获得的基因组dna。
26.具体地，在实验中具体操作步骤中的吸附时间和最终洗脱体积(h2o)可以根据具体实验条件进行优化。
27.使用所述方法提取粪便中肠道脱落细胞dna，在保证提取得到的dna质量的同时，对提取流程进行简化整个提取流程简单、快捷，耗时较短，更利于自动化提取。
28.优选地，步骤1)中每1g粪便样本加入10ml粪便保存液。
29.优选地，步骤2)中每5ml上清液加入3ml裂解液和50μl磁珠。
附图说明
30.图1为本发明实验例1中荧光定量pcr的结果。
具体实施方式
31.下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明之外，各实施例、实验例及对比例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到。
32.下述实施例及试验例中涉及到的部分生物材料、实验试剂、实验设备等情况简要介绍如下：
33.生物材料：
34.粪便样本来自本发明的发明人，实施例与对比例中提取所用的三份样本均为同一批次的相同样本。
35.实验试剂：
36.荧光定量pcr检测试剂购买自康为世纪，货号：cw0932m；对比例粪便核酸提取试剂盒购自海狸生物，货号：70411-100。
37.实验仪器：
38.荧光定量pcr仪购买自上海宏石医疗科技有限公司；mvm25多管振荡器购买自大龙兴创实验仪器有限公司。
39.实施例1一种粪便肠道脱落细胞核酸提取用试剂盒及核酸提取方法
40.本实施例的粪便肠道脱落细胞核酸提取用试剂盒，包括以下成分：粪便保存液、裂解液、洗涤液1、洗涤液2和磁珠，各组分配方如下：
41.粪便保存液各组分含量：2.5m硫氰酸胍、0.1m tris-hcl、0.15m nacl、5mm edta、0.5％ tritonx-100、0.5％％tween-20，ph为7.5；
42.裂解液各组分含量：7.5％ sds、3mm edta，ph为7.50；
43.洗涤液1各组分含量：70％(v/v)乙醇、0.05m tris-hcl、0.15m nacl；
44.洗涤液2各组分含量：0.075m tris-hcl、65％(v/v)乙醇。
45.本实施例的核酸提取方法使用实施例1中的试剂盒提取粪便样本中肠道脱落细胞的核酸，具体方法如下：
46.1)2.5粪便样本保存25ml液粪便保存液中。在掌上混匀仪上充分摇晃混匀粪便样本，4500rpm离心2分钟，取5ml上清于15ml离心管中；
47.2)向上清液中加入3ml裂解液、50μl磁珠，混匀后80℃10min；
48.3)将离心管置于多管混匀仪上1700rpm震荡10min，冷却至室温，将15ml离心管置于磁力架上吸附1min，弃去上清；
49.4)向15ml离心管中加入4ml洗涤液1，混匀后，置于磁力架上吸附1min，弃去上清；
50.5)向15ml离心管中加入4ml洗涤液2，混匀后，置于磁力架上吸附1min，弃去上清；
51.6)重复步骤5)；
52.7)向15ml离心管中加入1.5ml无水乙醇，将混合液体转移至2ml离心管，置于磁力架吸附1min，弃去上清；
53.8)室温干燥5min，加入50μl h2o，混匀仪震荡洗脱2min；
54.9)将离心管置于磁力架上吸附1min，将上清液转移至新的离心管中，此上清即为提取获得的基因组dna。
55.实施例2一种粪便肠道脱落细胞核酸提取用试剂盒及核酸提取方法
56.本实施例的粪便肠道脱落细胞核酸提取用试剂盒，包括以下成分：粪便保存液、裂解液、洗涤液1、洗涤液2和磁珠，各组分配方如下：
57.粪便保存液各组分含量：5m硫氰酸胍、0.1m tris-hcl、10mm edta、0.15m nacl、1％tritonx-100、1％tween-20，ph为8.0；
58.裂解液各组分含量：10％ sds、4mm edta，ph为8.0；
59.洗涤液1各组分含量：80％(v/v)乙醇、0.05m tris-hcl、0.15m nacl；
60.洗涤液2各组分含量：0.1m tris-hcl、70％(v/v)乙醇。
61.本实施例的核酸提取方法使用实施例2中的试剂盒提取粪便样本中肠道脱落细胞的核酸，具体方法下：
62.1)2.5粪便样本保存25ml液粪便保存液中。在掌上混匀仪上充分摇晃混匀粪便样本，4500rpm离心2分钟，取5ml上清于15ml离心管中；
63.2)向上清液中加入3ml裂解液、50μl磁珠，混匀后90℃8min；
64.3)将离心管置于多管混匀仪上1700rpm震荡10min，冷却至室温，将15ml离心管置
于磁力架上吸附1min，弃去上清；
65.4)向15ml离心管中加入4ml洗涤液1，混匀后，置于磁力架上吸附1min，弃去上清；
66.5)向15ml离心管中加入4ml洗涤液2，混匀后，置于磁力架上吸附1min，弃去上清；
67.6)重复步骤5)；
68.7)向15ml离心管中加入1.5ml无水乙醇，将混合液体转移至2ml离心管，置于磁力架吸附1min，弃去上清；
69.8)室温干燥5min，加入50μl h2o，混匀仪震荡洗脱2min；
70.9)将离心管置于磁力架上吸附1min，将上清液转移至新的离心管中，此上清即为提取获得的基因组dna。
71.实施例3一种粪便肠道脱落细胞核酸提取用试剂盒及核酸提取方法
72.本实施例的粪便肠道脱落细胞核酸提取用试剂盒，包括以下成分：粪便保存液、裂解液、洗涤液1、洗涤液2和磁珠，各组分配方如下：
73.粪便保存液各组分含量：1m硫氰酸胍、0.05m tris-hcl、2mm edta、0.15m nacl，0.1％tritonx-100、0.1％ tween-20，ph为7.0；
74.裂解液各组分含量：5％sds、2mm edta，ph为7.0；
75.洗涤液1各组分含量：60％乙醇、0.05m tris-hcl、0.15m nacl；
76.洗涤液2各组分含量：0.05m tris-hcl、60％(v/v)乙醇。
77.本实施例的核酸提取方法使用实施例3中的试剂盒提取粪便样本中肠道脱落细胞的核酸，具体方法如下：
78.1)2.5粪便样本保存25ml液粪便保存液中。在掌上混匀仪上充分摇晃混匀粪便样本，4500rpm离心2分钟，取5ml上清于15ml离心管中；
79.2)向上清液中加入3ml裂解液、50μl磁珠，混匀后70℃12min；
80.3)将离心管置于多管混匀仪上1700rpm震荡10min，冷却至室温，将15ml离心管置于磁力架上吸附1min，弃去上清；
81.4)向15ml离心管中加入4ml洗涤液1，混匀后，置于磁力架上吸附1min，弃去上清；
82.5)向15ml离心管中加入4ml洗涤液2，混匀后，置于磁力架上吸附1min，弃去上清；
83.6)重复步骤5)；
84.7)向15ml离心管中加入1.5ml无水乙醇，将混合液体转移至2ml离心管，置于磁力架吸附1min，弃去上清；
85.8)室温干燥5min，加入50μl h2o，混匀仪震荡洗脱2min；
86.9)将离心管置于磁力架上吸附1min，将上清液转移至新的离心管中，此上清即为提取获得的基因组dna。
87.对比例1
88.本发明还使用市售的粪便核酸提取试剂盒对样本进行核酸提取，具体操作说明如下：
89.1)取2.5g粪便样本至15ml离心管中；
90.2)加入3ml裂解液，再加入100μl蛋白酶k，调整合适的转速漩涡震荡1min，使其充分混合，再将离心管置于70℃加热20min，90℃加热10min，期间震荡混匀三次；
91.3)13000rpm离心3min，取1.5ml上清至一个新的15ml离心管中；
92.4)在上述15ml离心管中加入1.5ml结合液，200ul异丙醇，20ul磁珠悬液，震荡混匀30s，室温结合5min，期间颠倒混匀两次，将离心管置于磁性分离器上直至溶液澄清，用移液器移去上清液并取下离心管；
93.5)加入4ml洗涤液a，震荡混匀30s，室温下静置1min，期间上下颠倒混匀一次，将离心管置于磁性分离器上直至溶液澄清，用移液器移去上清液并取下离心管；
94.6)加入4ml洗涤液b，震荡混匀30s，室温下静置1min，期间上下颠倒混匀一次，将离心管置于磁性分离器上直至溶液澄清，用移液器移去上清液并取下离心管；
95.7)加入4ml洗涤液c，震荡混匀30s，室温下静置1min，期间上下颠倒混匀一次，将离心管置于磁性分离器上直至溶液澄清，用移液器移去上清液并取下离心管；
96.8)重复步骤7)一次；
97.9)保持离心管于磁力架上，将其置于超净工作台中风干至磁珠表面无明显光泽(5-7min)；
98.10)加入50μl 65℃预热的洗脱液，震荡混匀30s，于65℃加热5min，将离心管置于磁性分离器上直至溶液澄清，转移上清液至新的1.5ml离心管中，此即为纯化得到的基因组dna。
99.将上述实施例1～3和对比例1中提取的核酸采用qubit测量其浓度，实验结果如表1所示：
100.表1实施例1～3、对比例1所提取的核酸的浓度测定结果
101.样本名称实施例1实施例2实施例3对比例1样本110.2ng/ul9.8ng/ul10.7ng/ul5.4ng/ul样本29.6ng/ul10.6ng/ul8.5ng/ul6.3ng/ul样本311ng/ul11.3ng/ul10.0ng/ul4.9ng/ul
102.从实施例1～3和对比例1的对比可知，本发明的粪便肠道脱落细胞核酸提取试剂盒，操作步骤简单、耗时较短，3个具体实施例的试剂盒提取dna浓度都优于目前市场上常用的粪便核酸提取试剂盒。
103.实验例1荧光定量pcr验证
104.使用实施例1中提取的肠道脱落细胞dna，进行荧光定量pcr，具体的操作方法如下：
105.1)qpcr体系如表2所示：
106.表2 qpcr反应体系
107.[0108][0109]
2)qpcr反应条件如表3所示：
[0110]
表3 qpcr反应条件
[0111][0112]
3)内参基因引物序列如下表所示：
[0113]
名称序列actb-f(上游引物)gccgaggactttgattgcacaactb-r(下游引物)cttagagagaagtggggtggcttactb-p(探针)acttcctgtaacaacgca
[0114]
从图1可以看出，内参基因的ct值基本一致，说明使用本发明的提取方法提取肠道脱落细胞dna具有良好的重复性。
[0115]
综上所述，本发明的粪便肠道脱落细胞核酸提取试剂盒在保证提取得到的dna质量的同时，简化了操作流程，更利于实现自动化提取。
[0116]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。