TIMM8B突变基因、检测其的引物、试剂盒和方法以及其用途与流程

本发明涉及疾病相关突变基因，具体涉及一种timm8b突变基因、检测其的引物、试剂盒和方法以及其用途。

背景技术：

1、线粒体存在于绝大部分细胞中，是细胞能量生产的核心细胞器。线粒体功能受损可导致线粒体疾病。根据线粒体功能受损的程度、细胞类型和数量，线粒体疾病患者可出现各种各样的症状，受累器官主要包括心脏、肌肉、眼、耳和大脑等。

2、线粒体疾病的特别之处是，细胞核中的核基因组dna(ndna)的基因突变，以及细胞质中的线粒体基因组dna(mtdna)的基因突变均可导致线粒体疾病。mtdna基因突变导致的线粒体疾病，通常发病较晚；ndna基因突变导致的线粒体疾病，通常发病较早。在儿童期诊断的线粒体疾病中，由ndna基因突变导致的占比为75％。与成人线粒体疾病的较高诊断率不同，儿童期线粒体疾病由于症状特异性不高，诊断率显著下降。其中，婴儿致死性线粒体疾病(lethal infantile mitochondrial disease,limd)可导致新生儿期及婴儿期的极高死亡率。重症limd患儿发病骤及，甚至在出生后数日或数周内夭折，因而临床和基因诊断率更低。在国外报道limd病例中，很多是在尸检中才发现了线粒体疾病的蛛丝马迹。因此，国内外研究指出limd的发病率可能被严重低估。现阶段，虽然动物模型等基础研究中已发现千余种基因在线粒体的功能、稳定性、结构维持等方面发挥作用，但已报道的与limd相关的致病基因和致病变异却很少。

3、如能够被及时临床诊断，特别是精准基因诊断，limd患儿可通过调控能量代谢，有效降低死亡率，改善远期预后。此外，由于limd的基因诊断率低，部分患儿父母无法通过辅助生殖技术或产前诊断技术，阻断继续生育limd患儿，导致家庭悲剧再次出现。因此，发现新的limd致病基因，并建立快速、准确的新型检测试剂盒，对于提高limd的诊疗水平具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种与婴儿致死性线粒体疾病有关的timm8b突变基因、检测其的引物、试剂盒和方法以及其用途。

2、本发明的目的通过如下技术方案实现：

3、一种突变timm8b基因，所述突变timm8b基因与人类基因组参考序列grch37相比具有以下突变中的至少一种：

4、11号染色体物理位置为111957411的碱基由g突变为a、11号染色体物理位置为111957363的碱基由c突变为g；

5、所述突变timm8b基因的cdna序列与seq id no.1的序列相比具有如下突变中的至少一种：

6、c.37c>t、c.84+1g>c；

7、所述突变timm8b基因对应的突变timm8b蛋白的序列与seq id no.2的序列相比具有以下突变中的至少一种：

8、p.gln13ter(第13位谷氨酰胺突变为终止密码子)、或p.gln28_val29ins*7(第28位谷氨酰胺c端插入6个新氨基酸并在第7位为终止密码子)。

9、其中，所述seq id no.1与seq id no.2分别如下：

10、seq id no.1：

11、atgcgcaaacacagctgtcggaaggtggcgagcctgaggcgaacaatggcggagctgggcgaagccgatgaagcggagttgcagcgcctggtggccgccgagcagcagaaggcgcagtttactgcacaggtgcatcacttcatggagttatgttgggataaatgtgtggagaagccagggaatcgcctagactctcgcactgaaaattgtctctccagctgtgtagaccgcttcattgacaccactcttgccatcaccagtcggtttgcccagattgtacagaaaggagggcagtag

12、seq id no.2：

13、mrkhscrkvaslrrtmaelgeadeaelqrlvaaeqqkaqftaqvhhfmelcwdkcvekpgnrldsrtenclsscvdrfidttlaitsrfaqivqkggq

14、translocase of inner mitochondrial membrane 8b(线粒体内膜转位酶8b，timm8b)基因位于11号染色体11q23.1位置，该基因含有2个外显子，其编码的timm8b蛋白有98个氨基酸，分子量约为10.8kda。timm8b属于进化保守的蛋白质家族，在线粒体膜间空间中以异低聚复合物组织的形式。功能研究表明，timm8b介导疏水膜蛋白的导入和插入线粒体内膜，在线粒体功能中发挥重要作用。但目前timm8b与疾病的相关性尚不明确，未见相关文献报道。

15、野生型timm8b基因在ensemble数据库(www.ensembl.org)中的基因编码为ensg00000150779，该基因位于11号染色体。发明人在大量正常人和limd患者家系中利用遗传学研究筛选发现timm8b基因发生基因突变可以导致婴儿致死性线粒体疾病。本发明提供了新的致病基因的致病突变位点，为该疾病的早期分子筛查提供了新的分子生物学基础。

16、上述第一种突变、第二种突变均属于无效突变(null mutation)，其中第一种突变在11号染色体的物理位置为111957411，碱基g突变为a；rna水平：timm8b基因的cdna序列第37位碱基由c突变为t；蛋白水平：timm8b基因编码蛋白第13位谷氨酰胺突变为终止密码子。

17、第二种突变在11号染色体的物理位置为111957363，碱基由c突变为g，rna水平：timm8b基因的cdna序列第84+1位的内含子碱基由g突变为c；蛋白水平：timm8b基因编码蛋白第28位谷氨酰胺c端插入6个新氨基酸并在第7位为终止密码子。

18、一种检测突变timm8b基因的方法，所述方法用于非诊断目的，所述方法包括检测timm8b基因是否存在突变位点；

19、所述突变位点为如下至少一种：

20、chr11(grch37):g.111957411g>a，cdna序列发生c.37c>t，p.gln13ter(第13位谷氨酰胺突变为终止密码子)；

21、chr11(grch37):g.111957363c>g，cdna序列发生c.84+1g>c，p.gln28_val29ins*7；第28位谷氨酰胺c端插入6个新氨基酸并在第7位为终止密码子。

22、在一些实施方案中，本发明中所述的非诊断疾病的目的包括但不限于研究snp分布和多肽性，用于家族演化研究。这样的应用是本领域技术人员可以理解的。

23、有些个体携带本发明的突变timm8b基因但不患limd，例如仅一条染色体携带所述突变的杂合基因型。对这部分人群的检测可以不涉及任何诊断疾病的目的，因为这些个体本身并不患病。但对于他们进行检测的结果可以作为有用的信息使用，例如作为育前检查的重要指标，指导生育，或者用于突变携带者筛查，或者作为snp分布和多态性研究的工具或者追踪基因突变或家族演化。这样的应用也是本领域技术人员可以理解的。因此，本发明提供的检测突变timm8b基因或突变timm8b蛋白的方法涉及检测杂合突变。

24、但本发明提供的检测突变timm8b基因的方法也包括检测纯合突变。

25、在本发明应用较佳的实施方式中，上述检测突变timm8b基因的方法包括利用如下至少一组引物进行pcr扩增的步骤：

26、timm8b_e1f：cctcatcttgcccggactacta(seq id no:3)，

27、timm8b_e1rseq：gggatcgagcaccagtgagc(seq id no:4)；

28、timm8b_e2fseq：tctgtagggacgaggatctgga(seq id no:5)，

29、timm8b_e2r：gcctgatgctgatctgacaatg(seq id no:6)。

30、在本发明应用较佳的实施方式中，上述采用引物进行扩增的pcr反应程序包括：96℃ 10min；96℃ 30s，65℃ 30s，72℃ 30s(循环35次)；72℃ 8min。

31、检测突变timm8b基因的方法包括如下步骤：

32、(1)建立limd患者家系临床与遗传资源库，收集limd家系的临床信息与血液样本，提取基因组dna；

33、(2)设计覆盖timm8b基因全外显子序列的扩增和测序引物进行测序；

34、(3)比对正常人和limd患者家系样本的测序结果。

35、在其中一种实施方式中，上述序列测定是sanger序列测定。

36、在其他实施方式中，上述检测突变timm8b基因的方法还可以选自如下的技术进行：

37、核酸电泳、核酸杂交、ddpcr和变性高效液相色谱。

38、在其他实施方式中，还涉及检测timm8b基因外显子和外显子/内含子边界突变的方法，其包括如下步骤：

39、(1)从受试者提取dna样本；

40、(2)对上述dna样品的外显子组和所有外显子/内含子边界序列进行测序得到测序片段；

41、(3)将上述测序片段与参考序列比对，得到基因外显子和外显子/内含子边界突变。

42、一种检测突变timm8b基因的试剂，所述试剂为核酸检测探针或引物；

43、所述核酸检测探针与突变timm8b基因互补；所述突变timm8b基因与人类基因组参考序列grch37相比具有以下突变中的至少一种：

44、11号染色体物理位置为111957411的碱基由g突变为a、11号染色体物理位置为111957363的碱基由c突变为g；

45、所述突变timm8b基因的cdna序列与seq id no.1的序列相比具有如下突变中的至少一种：

46、c.37c>t、c.84+1g>c；

47、所述核酸检测探针与突变timm8b基因互补的区域包括选自如下至少一种的物理位置或cdna序列位置：

48、物理位置为11号染色体的第111957411位、11号染色体的第111957363位；cdna序列第37位、第84+1位；

49、所述引物为具有如下序列的至少一组引物：

50、timm8b_e1f：cctcatcttgcccggactacta(seq id no:3)，

51、timm8b_e1rseq：gggatcgagcaccagtgagc(seq id no:4)；

52、timm8b_e2fseq：tctgtagggacgaggatctgga(seq id no:5)，

53、timm8b_e2r：gcctgatgctgatctgacaatg(seq id no:6)

54、核酸检测探针通过与突变timm8b基因的互补区核酸配对从而实现突变timm8b基因的检测。

55、在其他实施方式中，检测突变timm8b基因的试剂还包括缓冲液，酶，无机盐。

56、采用检测突变timm8b基因的引物对模板dna进行扩增，通过测序或凝胶电泳对扩增产物进行突变鉴定。

57、一种检测突变timm8b基因的试剂盒，它包括所述的试剂。

58、在其他实施方式中，上述检测突变timm8b基因的试剂盒还包括缓冲液、使用说明书。

59、一种检测突变timm8b基因的试剂在制备婴儿致死性线粒体疾病检测试剂中的应用；

60、所述婴儿致死性线粒体疾病检测试剂为基因芯片用试剂、dna扩增用试剂、限制性内切酶酶切方法用试剂或测序用试剂。

61、dna扩增用试剂可以是引物，探针。

62、限制性内切酶酶切方法用试剂可以是含限制性内切酶位点的引物，无缝克隆缓冲液。

63、测序用试剂可以是引物，检测缓冲液。

64、一种检测突变timm8b基因的试剂在婴儿致死性线粒体疾病早期分子筛查中的应用，该应用为非疾病的诊断目的。

65、一种检测突变timm8b基因的试剂盒在婴儿致死性线粒体疾病早期分子筛查中的应用，该应用为非疾病的诊断目的。

66、较之现有技术而言，本发明的优点在于：

67、本发明提供了一种timm8b突变基因、检测其的试剂、引物、试剂盒和方法以及其用途，创造性的挖掘出一种limd致病基因timm8b，并提供了timm8b突变基因位点，这为婴儿致死性线粒体疾病的早期分子筛查、家族遗传研究、遗传咨询提供了重要的依据。