一种RNA的制备方法、合成蛋白质的方法以及转录反应液与流程

1-醇、环己烷-1,2,3,4,5,6-六醇、2-(2-丙基)-5-甲基-环己烷-1-醇、二甲基亚砜、甲基仲丁基亚砜、正丙基亚砜、正丁基亚砜、四亚甲基亚砜、三乙醇胺以及乙二醇中的至少一种。
13.可选地，糖包括海藻糖以及甘露糖中的至少一种。
14.可选地，糖醇包括山梨醇以及木糖醇中的至少一种。
15.可选地，生物碱包括甜菜碱。
16.可选地，蛋白变性剂包括尿素、盐酸胍、异硫氰酸胍、苯酚、亚硫酸盐以及硫代硫酸盐中的至少一种。
17.可选地，有机溶剂的体积占转录反应液的总体积的百分比为0.1-70.0％。
18.可选地，核酸变性剂包括终摩尔浓度为1.0mm-10.0m的海藻糖、终摩尔浓度为1.0mm-10.0m的甜菜碱、终摩尔浓度为1.0mm-10.0m的尿素、终摩尔浓度为1.0mm-10.0m的异硫氰酸胍、终摩尔浓度为1.0mm-10.0m的盐酸胍、终摩尔浓度为1.0mm-10.0m的山梨醇、终摩尔浓度为1.0mm-10.0m的木糖醇和终摩尔浓度为1.0mm-10.0m的甘露糖中的至少一种；其中，终摩尔浓度为溶质的物质的量与转录反应液的总体积之比。
19.可选地，核酸变性剂包括乙醇和尿素；乙醇在转录反应液的总体积的百分比为1.5-15.0％；尿素在转录反应液中的终浓度为40.0mm-1.2m。
20.可选地，核酸变性剂包括乙醇、甲酰胺和海藻糖；乙醇与甲酰胺分别占转录反应液的总体积的百分比均为0.5-5.0％；海藻糖在转录反应液中的终浓度为5.0mm-0.5m。
21.本技术通过在转录反应液中加入核酸变性剂，从转录制备rna合成端，有效抑制dsrna的生成，显著提高体外转录后的体系中ssrna的纯度，从而提高ssrna的体内稳定性、翻译效率以及降低ssrna的免疫原性，操作简单。
附图说明
22.为了更清楚地说明本技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
23.图1示出了本技术实施例51-56以及对比例1提供的ivt反应后的dsrna含量图。
24.图2示出了本技术实施例57-59以及对比例1提供的ivt反应后的dsrna含量图。
25.图3示出了本技术实施例51-56以及对比例1提供的小鼠体内ifnα的含量图。
26.图4示出了本技术实施例56、59以及对比例1提供的小鼠体内epo的含量图。
具体实施方式
27.为使本技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
28.下面对本发明实施例提供的rna的制备方法、合成蛋白质的方法以及转录反应液进行具体说明。
29.在本技术中，单位“m”是指mol/l；“mm”是指mmol/l；ssrna(single-stranded rna)
是指单链核糖核酸，dsrna(double-stranded rna)是指双链核糖核酸；ivt(in vitro transcription)是指体外转录；ntps(nucleoside triphosphates)是指核苷三磷酸。蛋白变性剂，是指会使得蛋白质发生变性作用的物质。
30.本技术提供一种rna的制备方法，包括将原料混合后进行转录反应。
31.原料包括dna模板、rna聚合酶、ntps、含有镁离子的缓冲液以及核酸变性剂；核酸变性剂包括有机溶剂、糖、糖醇、生物碱以及蛋白变性剂中的至少一种。
32.在本技术中，含有镁离子的缓冲液中的镁离子与ntps和dna模板结合形成复合体以使得dna模板中的启动子被rna聚合酶识别。以dna模板的中模板链为模板，以ntps为原料，在rna聚合酶催化下进行ivt以合成rna。
33.通过在ivt反应前的体系中加入核酸变性剂，可以从转录制备rna合成端有效抑制dsrna的生成，显著提高体外转录后的体系中ssrna的纯度，从而提高ssrna的体内稳定性、翻译效率以及降低ssrna的免疫原性，操作简单。
34.在本技术的一些实施例中，有机溶剂包括甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、戊醇、聚乙二醇、甲酰胺、1,2,3,4,5-戊五醇、1,2,3,4,5,6-己六醇、丙-2-烯-1-醇、3,7-二甲基庚-2,6-二烯-1-醇、2-丙炔-1-醇、环己烷-1,2,3,4,5,6-六醇、2-(2-丙基)-5-甲基-环己烷-1-醇、二甲基亚砜、甲基仲丁基亚砜、正丙基亚砜、正丁基亚砜、四亚甲基亚砜、三乙醇胺以及乙二醇中的至少一种。上述有机溶剂可以从转录制备rna合成端有效抑制dsrna的生成，进而显著提高体外转录后的体系中ssrna的纯度。可以理解的是，在本技术的其他实施例中，有机溶剂也可以不限于上述溶剂。
35.进一步地，有机溶剂包括乙醇、甲酰胺以及二甲基亚砜中的至少一种。乙醇、甲酰胺或者二甲基亚砜作为核酸变性剂在ivt反应前加入至反应体系中，可以有效抑制dsrna的生成(转录后体系中dsrna含量至1.0％以下)，进而显著提高体外转录后的体系中ssrna的纯度。在一些实施例中，有机溶剂包括乙醇和甲酰胺。乙醇和甲酰胺相互配合，可以有效抑制dsrna的生成(转录后体系中dsrna含量至0.5％以下)，显著提高体外转录后的体系中ssrna的纯度。
36.在本实施例中，糖包括海藻糖以及甘露糖中的至少一种；糖醇包括山梨醇以及木糖醇中的至少一种；生物碱包括甜菜碱；蛋白变性剂包括尿素、盐酸胍、异硫氰酸胍、苯酚、亚硫酸盐以及硫代硫酸盐中的至少一种。上述物质可以从转录制备rna合成端有效抑制dsrna的生成，进而显著提高体外转录后的体系中ssrna的纯度。
37.在本技术的一些实施例中，核酸变性剂包括海藻糖、甜菜碱、尿素、异硫氰酸胍、盐酸胍、山梨醇、木糖醇以及甘露糖中的至少一种。
38.进一步地，核酸变性剂包括海藻糖、甜菜碱、尿素以及异硫氰酸胍中的至少一种。上述物质可以从转录制备rna合成端有效抑制dsrna的生成(转录后体系中dsrna含量至1.0％以下)，进而显著提高体外转录后的体系中ssrna的纯度。可以理解的是，在本技术的其他实施例中，核酸变性剂也可以不限于上述物质。
39.进一步地，核酸变性剂包括海藻糖和尿素。海藻糖和尿素相互配合，可以有效抑制dsrna的生成(转录后体系中dsrna含量至0.2％以下)，从而显著提高体外转录后的体系中ssrna的纯度。
40.在本技术的一些实施例中，核酸变性剂包括终摩尔浓度为1.0mm-10.0m的海藻糖、
终摩尔浓度为1.0mm-10.0m的甜菜碱、终摩尔浓度为1.0mm-10.0m的尿素、终摩尔浓度为1.0mm-10.0m的异硫氰酸胍、终摩尔浓度为1.0mm-10.0m的盐酸胍、终摩尔浓度为1.0mm-10.0m的山梨醇、终摩尔浓度为1.0mm-10.0m的木糖醇和终摩尔浓度为1.0mm-10.0m的甘露糖中的至少一种；其中，终摩尔浓度为溶质的物质的量与原料的总体积之比。作为示例性地，核酸变性剂包括海藻糖，海藻糖在原料混合后的体系中的终摩尔浓度可以为1.0mm、2.5mm、5.0mm、25.0mm、40.0mm、0.25m、0.5m、1.2m、2.5m、4.0m以及10.0m等等。上述终摩尔浓度可以进一步抑制dsrna的生成，提高体外转录后的体系中ssrna的纯度。
41.进一步地，核酸变性剂包括终摩尔浓度为2.5mm-4.0m的海藻糖、终摩尔浓度为2.5mm-4.0m的甜菜碱、终摩尔浓度为2.5mm-4.0m的尿素、终摩尔浓度为2.5mm-4.0m的异硫氰酸胍、终摩尔浓度为2.5mm-4.0m的盐酸胍、终摩尔浓度为2.5mm-4.0m的山梨醇、终摩尔浓度为2.5mm-4.0m的木糖醇和终摩尔浓度为2.5mm-4.0m的甘露糖中的至少一种。进一步地，核酸变性剂包括终摩尔浓度为0.5m-1.2m的海藻糖、终摩尔浓度为0.5m-1.2m的甜菜碱、终摩尔浓度为0.5m-1.2m的尿素、终摩尔浓度为0.5m-1.2m的异硫氰酸胍、终摩尔浓度为0.5m-1.2m的盐酸胍、终摩尔浓度为0.5m-1.2m的山梨醇、终摩尔浓度为0.5m-1.2m的木糖醇和终摩尔浓度为0.5m-1.2m的甘露糖中的至少一种。
42.作为示例性地，核酸变性剂包括终摩尔浓度为5.0mm-0.5m海藻糖、终摩尔浓度为5.0mm-0.5m异硫氰酸胍、终摩尔浓度为5.0mm-0.5m山梨醇以及终摩尔浓度为5.0mm-0.5m木糖醇中的至少一种。或者，核酸变性剂包括终摩尔浓度为2.5mm-0.25m的甘露糖。或者，核酸变性剂包括终摩尔浓度为25.0mm-2.5m的甜菜碱。或者，核酸变性剂包括终摩尔浓度为40.0mm-4.0m的尿素。
43.在本技术的一些实施例中，有机溶剂占原料的总体积的百分比为0.1-70.0％。作为示例性地，有机溶剂占原料的总体积的百分比可以为0.1％、0.5％、1.5％、5.0％、10.0％、15.0％、30.0％、50.0％以及70.0％等等。有机溶剂的上述体积百分比可以进一步抑制dsrna的生成，提高体外转录后的体系中ssrna的纯度。需要说明的是，在本请的其他实施例中，有机溶剂占原料的总体积的百分比也可以不限于上述体积百分比。
44.进一步地，有机溶剂占原料的总体积的百分比为0.5-50.0％。进一步地，有机溶剂占原料的总体积的百分比为10.0-15.0％。
45.在本技术中，核酸变性剂可以仅包括有机溶剂、糖、糖醇、生物碱以及蛋白变性剂中的一种，可以包括有机溶剂、糖、糖醇、生物碱以及蛋白变性剂中的其中几种；也同时包括有机溶剂、糖、糖醇、生物碱以及蛋白变性剂。
46.在本技术中，核酸变性剂可以仅包括有机溶剂，可以仅包括海藻糖、甜菜碱、尿素、异硫氰酸胍、盐酸胍、山梨醇、木糖醇以及甘露糖中的至少一种，也可以同时包括海藻糖、甜菜碱、尿素、异硫氰酸胍、盐酸胍、山梨醇、木糖醇以及甘露糖中的至少一种和有机溶剂。
47.在本技术的一些实施例中，核酸变性剂包括乙醇和尿素；乙醇占原料的总体积的百分比为1.5-15.0％；尿素在原料混合后的体系中的终摩尔浓度为40.0mm-1.2m；其中，终摩尔浓度为溶质的物质的量与原料的总体积之比。作为示例性地，乙醇占原料的总体积的百分比可以为0.5％、1.5％、5.0％、10.0％以及15.0％等等；尿素在原料混合后的体系中的终摩尔浓度可以为40.0mm、0.12m、0.4m以及1.2m等等。相比于乙醇或者尿素单独作为核酸变性剂，乙醇和尿素相互配合，协同抑制dsrna的生成，至转录后体系中dsrna含量低至
0.02％，进而显著提高体外转录后的体系中ssrna的纯度高达99.98％。
48.在本技术的一些实施例中，核酸变性剂包括乙醇、甲酰胺和海藻糖；乙醇与甲酰胺分别占原料的总体积的百分比均为0.5-5.0％；海藻糖在原料混合后的体系中的终摩尔浓度为5.0mm-0.5m；其中，终摩尔浓度为溶质的物质的量与原料的总体积之比。作为示例性地，乙醇占原料的总体积的百分比可以为0.5％、1.5％、3.5％、4.0％以及5.0％等等，甲酰胺占原料的总体积的百分比可以为0.5％、1.5％、3.5％、4.0％以及5.0％等等；乙醇占原料的总体积的百分比和甲酰胺占原料的总体积的百分比可以相同，也可以不同。海藻糖在原料混合后的体系中的终摩尔浓度可以为5.0mm、15mm、30mm、50mm、0.1m、0.2m以及0.5m等等。相比于乙醇、甲酰胺或者海藻糖单独作为核酸变性剂，乙醇、甲酰胺和海藻糖三者之间相互配合，协同抑制dsrna的生成，至转录后体系中dsrna含量低至0.02％，进而显著提高体外转录后的体系中ssrna的纯度高达99.98％。
49.dna模板指含有rna启动子的dna序列，其来源包括但不限于pcr和质粒dna。作为示例性地，dna模板可以包含t7启动子(taatacgactcactataggg)或者sp6启动子(atttaggtgacactatag)。需要说明的是，在本技术的其他实施例中，dna模板包含的rna启动子也不限于上述启动子。
50.在本技术的一些实施例中，dna模板在原料混合后的体系中的终质量浓度为1-500ng/μl。作为示例性地，dna模板在原料混合后的体系中的终质量浓度可以为1ng/μl、5ng/μl、25ng/μl、50ng/μl、100ng/μl、200ng/μl以及500ng/μl等等。
51.rna聚合酶可以选用天然的或者非天然的rna聚合酶。作为示例性地，rna聚合酶可以选用t7 rna聚合酶、t3 rna聚合酶或者sp6 rna聚合酶。需要说明的是，在本技术的其他实施例中，rna聚合酶也不限于上述rna聚合酶。
52.在本技术的一些实施例中，rna聚合酶为t7 rna聚合酶，t7rna聚合酶在原料混合后的体系中的终浓度为0.5-50u/μl。作为示例性地，t7 rna聚合酶在原料混合后的体系中的终浓度可以为0.5u/μl、2.5u/μl、10u/μl、20u/μl、40u/μl以及50u/μl等等。
53.ntps是核苷三磷酸，ntps可以为天然的或者非天然的核苷三磷酸。在本实施例中，ntps可以包括atp(腺嘌呤核苷三磷酸)、ctp(三磷酸胞苷)、gtp(三磷酸鸟苷)以及utp(三磷酸尿苷)等等。需要说明的是，在本技术的其他实施例中，ntps也不限于上述核苷三磷酸。
54.在本技术的一些实施例中，atp、ctp、gtp以及utp在原料混合后的体系中的终浓度各自独立地为0.5-20mm。作为示例性地，atp、ctp、gtp或者utp分别在原料混合后的体系中的终浓度可以为0.5mm、1mm、5mm、8mm、10mm、16mm以及20mm等等。
55.含有镁离子的缓冲液是维持rna合成体系中的ph值稳定的关键因素。在本实施例中，含有镁离子的缓冲液可以包含mgcl2、tris-hcl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)、亚精胺以及dtt(二硫苏糖醇)。需要说明的是，在本技术的实施例中，含有镁离子的缓冲液中的物质也不限于上述物质。
56.在本技术的一些实施例中，mgcl2在原料混合后的体系中的终浓度为2-70mm。作为示例性地，mgcl2在原料混合后的体系中的终浓度可以为2mm、5mm、20mm、46mm、60mm以及70mm等等。在本技术的一些实施例中，tris-hcl的ph为6.0-9.0；作为示例性地，tris-hcl的ph可以为6.0、7.2、7.9、8.3以及9.0等等。在本技术的一些实施例中，tris-hcl在原料混合后的体系中的终浓度为10-100mm；作为示例性地，tris-hcl在原料混合后的体系中的终浓
度可以为10mm、20mm、40mm、80mm以及100mm等等。在本技术的一些实施例中，亚精胺的在原料混合后的体系中的终浓度为0.1-5mm；作为示例性地，亚精胺的终浓度可以为0.1mm、0.5mm、2mm以及5mm等等。在本技术的一些实施例中，dtt在原料混合后的体系中的终浓度为1-50mm；作为示例性地，dtt在原料混合后的体系中的终浓度可以为1mm、5mm、10mm、20mm以及50mm等等。
57.在本实施例中，原料还包括无机焦磷酸酶、核酸酶抑制剂以及无核酸酶水。在本技术的一些实施例中，无机焦磷酸酶在原料混合后的体系中的终浓度为0.0001-0.1u/μl；作为示例性地，无机焦磷酸酶在原料混合后的体系中的终浓度可以为0.0001u/μl、0.001u/μl、0.005u/μ、0.01u/μl、0.05u/μl以及0.1u/μl等等。在本技术的一些实施例中，核酸酶抑制剂的在原料混合后的体系中的终浓度为0.1-5u/μl；作为示例性地，核酸酶抑制剂在原料混合后的体系中的终浓度0.1u/μl、0.5u/μ、1u/μl、2u/μl以及5u/μl等等。
58.在本实施例中，转录反应的温度为20-60℃，转录反应的时间为15min-10h。作为示例性地，转录反应的温度可以为20℃、25℃、37℃、50℃以及60℃等等；转录反应的时间可以为15min、30min、2h、6h以及10h等等。上述转录反应温度以及转录反应时间可以保持转录反应稳定进行。
59.在本实施例中，在转录反应后还包括加入不含rna酶污染的dnase i酶(deoxyribonuclease i，脱氧核糖核酸酶i，是一种可以消化单链或双链dna产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶)于25-45℃下消化原始dna模板5-60min。作为示例性地，消化原始dna模板的温度可以为25℃、30℃、37℃、42℃以及45℃等等；消化原始dna模板的时间可以为5min、10min、20min、25min、30min、40min以及60min等等。上述消化原始dna模板的温度以及时间可以很好地消化原始dna模板，有利于提高体外转录后的体系中ssrna的纯度。
60.本技术还提供一种合成蛋白质的方法，包括采用上述的rna的制备方法制备rna；然后以rna为模板合成蛋白质。
61.直接以本技术第一方面提供的rna的制备方法所制备的rna为模板合成蛋白质，由于本技术第一方面提供的rna的制备方法有效抑制了dsrna的产生使得所制备的rna中的ssrna的纯度较高，有利于提高蛋白质的翻译效率。
62.在本技术的一些实施例中，合成的蛋白质可以为治疗用途的蛋白质或者疫苗用途的蛋白质。治疗用途的蛋白质可以通过功能性蛋白的表达治疗基因缺陷性疾病或组织修复，疫苗用途的蛋白质可通过抗原抗体或受体的表达用于免疫治疗。
63.本技术还提供一种转录反应液，包括dna模板、rna聚合酶、ntps、含有镁离子的缓冲液以及核酸变性剂；核酸变性剂包括有机溶剂、糖、糖醇、生物碱以及蛋白变性剂中的至少一种。
64.在本技术的一些实施例中，有机溶剂包括甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、戊醇、聚乙二醇、甲酰胺、1,2,3,4,5-戊五醇、1,2,3,4,5,6-己六醇、丙-2-烯-1-醇、3,7-二甲基庚-2,6-二烯-1-醇、2-丙炔-1-醇、环己烷-1,2,3,4,5,6-六醇、2-(2-丙基)-5-甲基-环己烷-1-醇、二甲基亚砜、甲基仲丁基亚砜、正丙基亚砜、正丁基亚砜、四亚甲基亚砜、三乙醇胺以及乙二醇中的至少一种。
65.在本技术的一些实施例中，糖包括海藻糖以及甘露糖中的至少一种。
66.在本技术的一些实施例中，糖醇包括山梨醇以及木糖醇中的至少一种。
67.在本技术的一些实施例中，生物碱包括甜菜碱。
68.在本技术的一些实施例中，蛋白变性剂包括尿素、盐酸胍、异硫氰酸胍、苯酚、亚硫酸盐以及硫代硫酸盐中的至少一种。
69.在本技术的一些实施例中，有机溶剂的体积占转录反应液的总体积的百分比为0.1-70.0％。
70.在本技术的一些实施例中，核酸变性剂包括终摩尔浓度为1.0mm-10.0m的海藻糖、终摩尔浓度为1.0mm-10.0m的甜菜碱、终摩尔浓度为1.0mm-10.0m的尿素、终摩尔浓度为1.0mm-10.0m的异硫氰酸胍、终摩尔浓度为1.0mm-10.0m的盐酸胍、终摩尔浓度为1.0mm-10.0m的山梨醇、终摩尔浓度为1.0mm-10.0m的木糖醇和终摩尔浓度为1.0mm-10.0m的甘露糖中的至少一种；其中，终摩尔浓度为溶质的物质的量与转录反应液的总体积之比。
71.在本技术的一些实施例中，核酸变性剂包括乙醇和尿素；乙醇在转录反应液的总体积的百分比为1.5-15.0％；尿素在转录反应液中的终摩尔浓度为40.0mm-1.2m。
72.在本技术的一些实施例中，核酸变性剂包括乙醇、甲酰胺和海藻糖；乙醇与甲酰胺分别占转录反应液的总体积的百分比均为0.5-5.0％；海藻糖在转录反应液中的终摩尔浓度为5.0mm-0.5m。
73.本技术提供的转录反应液至少具有以下优点：
74.本技术通过在转录反应液中加入核酸变性剂，从转录制备rna合成端，有效抑制dsrna的生成，显著提高体外转录后的体系中ssrna的纯度，从而提高ssrna的体内稳定性、翻译效率以及降低ssrna的免疫原性，操作简单。
75.实施例1
76.本实施例提供了一种转录反应液以及一种rna的制备方法。
77.含有镁离子的缓冲液(10x)的配置：将tris-hcl(ph＝7.9)、mgcl2、亚精胺以及dtt混合制得含有镁离子的缓冲液(10x)；其中，tris-hcl的浓度为400mm，mgcl2的浓度为460mm，亚精胺的浓度为20mm，dtt的浓度为100mm。
78.混合酶的配置：将t7 rna聚合酶、无机焦磷酸酶以及核酸酶抑制剂混合制得混合酶体系；其中，t7 rna聚合酶的浓度为400u/μl，无机焦磷酸酶的浓度为0.1u/μl，核酸酶抑制剂的浓度为20u/μl。
79.转录反应液的配置：将2μl的含有镁离子的缓冲液(10x)、1μl 200mm的atp、1μl 200mm的gtp、1μl 200mm的ctp、1μl 200mm的utp、1μl的混合酶、1μl 1μg/μl的dna模板以及0.1μl的乙醇混合后，加入无核酸酶水至20μl制得转录反应液；其中dna模板为合成促红细胞生成素(epo，erythropoietin(human))mrna的dna模板，上述dna模板包含t7启动子，上述dna模板的序列参见chromosome 7-nc_000007.14。
80.将转录反应液在37℃下转录反应2h后，加入1μl 1u/μl的dnase i酶于37℃消化原始dna模板30min。
81.实施例2-59以及对比例1
82.实施例2-59以及对比例1分别提供了一种转录反应液以及一种rna的制备方法。请参阅实施例1，实施例2-56以及对比例1与实施例1的核酸变性剂不同，详见表1；实施例57-59与实施例1的核酸变性剂不同，详见表2。
83.表1
84.85.[0086][0087]
表2
[0088][0089]
说明：表1和表2中的“非有机溶剂的核酸变性剂”是指除去有机溶剂的核酸变性剂。
[0090]
对比例2
[0091]
对比例2分别提供了一种转录反应液以及一种rna的制备方法。对比例2与实施例1的不同之处在于核酸变性剂不是在转录反应液中加入的，在对比例2中，核酸变性剂是在加入dnase i酶消化原始dna模板之后才加入到体系中的。具体如下：
[0092]
含有镁离子的缓冲液(10x)的配置：将tris-hcl(ph＝7.9)、mgcl2、亚精胺以及dtt混合制得含有镁离子的缓冲液(10x)；其中，tris-hcl的浓度为400mm，mgcl2的浓度为460mm，亚精胺的浓度为20mm，dtt的浓度为100mm。
[0093]
混合酶的配置：将t7 rna聚合酶、无机焦磷酸酶以及核酸酶抑制剂混合制得混合
酶体系；其中，t7 rna聚合酶的浓度为400u/μl，无机焦磷酸酶的浓度为0.1u/μl，核酸酶抑制剂的浓度为20u/μl。
[0094]
转录反应液的配置：将2μl的含有镁离子的缓冲液(10x)、1μl 200mm的atp、1μl 200mm的gtp、1μl 200mm的ctp、1μl 200mm的utp、1μl的混合酶以及1μl x的dna模板混合后，加入无核酸酶水至20μl制得转录反应液；其中dna模板为合成促红细胞生成素(epo，erythropoietin(human))mrna的dna模板，上述dna模板包含t7启动子，上述dna模板的序列参见chromosome 7-nc_000007.14。
[0095]
将转录反应液在37℃下转录反应2h后，加入1μl 1u/μl的dnase i酶于37℃消化原始dna模板30min后，加入10.0μl的乙醇，即得rna产物。
[0096]
对比例3-11
[0097]
对比例3-11分别提供了一种转录反应液以及一种rna的制备方法，对比例3-11的核酸变性剂也是在加入dnase i酶消化原始dna模板之后才加入到体系中的。对比例3-11与对比例2的区别在于核酸变性剂不同，详见表3。
[0098]
表3
[0099][0100]
说明：表3中的“非有机溶剂的核酸变性剂”是指除去有机溶剂的核酸变性剂。
[0101]
试验例1
[0102]
对实施例1-59以及对比例1-11提供的转录反应液以及rna的制备方法得到的rna进行dsrna含量的检测。检测结果如表4所示。其中，dsrna含量的检测方法采用sandwich elisa(双抗体夹心酶联免疫吸附试验)法；检测方法如下：
[0103]
首先对微孔板做包被抗体k1(scicons,budapest,hungary)，加入dsrna后形成抗原抗体复合物，然后加入检测抗体k2(scicons,budapest,hungary)，再加入tmb(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)显色液显色，室温孵育20～30min，当标准品出现蓝色梯度后，加入终止液(0.16m的硫酸)终止反应，用酶标仪在450nm波长读取吸光值，根据标准曲线可以计算出待测样品中的dsrna浓度，待测样品中的dsrna含量(％)为待测样品中的dsrna浓度与待测样品中rna产物的总浓度之比。
[0104]
其中，标准曲线的建立：用酶标仪分别测定不同浓度(ng/ml)的dsrna标准样品standard1-8的在450nm的吸光值，建立浓度与吸光值(od
450
)的关系标准曲线。
[0105]
表4
[0106]
[0107][0108]
从表4可以看出：实施例1-59中dsrna含量明显低于对比例1中dsrna含量。通过在ivt反应前的体系中加入核酸变性剂，可以有效抑制dsrna的生成。
[0109]
对比例2-11均是在ivt反应后的体系中加入核酸变性剂，并无法有效降低dsrna的含量。即在ivt反应后的体系中加入核酸变性剂无法将dsrna的双螺旋结构打开以使dsrna变性成ssrna，无法有效降低体系中dsrna的含量。
[0110]
进一步地，实施例4和实施例5分别在ivt反应前的体系中单独加入3μl或10μl的乙醇，dsrna含量分别为0.9％和0.8％；实施例44和实施例45分别在ivt反应前的体系中单独加入3μl或10μl的8m尿素，dsrna含量分别为0.9％和0.2％；实施例56在ivt反应前的体系中同时加入3.0μl乙醇和3.0μl 8m的尿素，dsrna含量仅为0.02％。可见，在ivt反应前的体系中同时加入乙醇和尿素再进行转录反应后的dsrna含量明显低于在ivt反应前的体系中单独加入乙醇或尿素再进行转录反应后的dsrna含量。因此，乙醇和尿素相互配合协同抑制dsrna的生成。
[0111]
进一步地，实施例3在ivt反应前的体系中单独加入1.0μl的乙醇，dsrna含量为1.1％；实施例30在ivt反应前的体系中单独加入10μl 1.0m的海藻糖，dsrna含量为1.0％；实施例48在ivt反应前的体系中单独加入1.0μl的甲酰胺，dsrna含量为0.6％；实施例59在ivt反应前的体系中同时加入1.0μl的甲酰胺、1.0μl的乙醇以及10μl 1m的海藻糖，dsrna含量仅为0.02％。可见，在ivt反应前的体系中同时加入甲酰胺、乙醇和海藻糖再进行转录反应后的dsrna含量明显低于在ivt反应前的体系中单独加入甲酰胺、乙醇或海藻糖再进行转录反应后的dsrna含量。因此，乙醇、甲酰胺和海藻糖三者之间相互配合协同抑制dsrna的生成。
[0112]
试验例2
[0113]
对实施例51-59以及对比例1-11提供的转录反应液以及rna的制备方法得到的rna进行hplc(高效液相色谱)纯化以去除dsrna。实施例51-59以及对比例1-11得到的rna进行hplc纯化后的dsrna含量进行检测。检测结果如表5、图1和图2所示。
[0114]
表5
[0115][0116]
从表5可以看出：实施例56在ivt反应前的体系中同时加入3.0μl乙醇和3.0μl 8m的尿素，hplc纯化前dsrna含量为0.02％，hplc纯化后dsrna含量也为0.02％，即无需纯化步骤，即可达到进行hplc纯化后的效果，操作简单。
[0117]
实施例59在ivt反应前的体系中同时加入1.0μl的甲酰胺、1.0μl的乙醇以及10μl 1m的海藻糖，hplc纯化后dsrna含量为0.02％，hplc纯化后dsrna含量也为0.02％，即无需纯化步骤，即可达到进行hplc纯化后的效果，操作简单。
[0118]
试验例3
[0119]
对实施例56、59以及对比例1的ivt后的rna的翻译效率以及免疫原性进行检测。将实施例56、59以及对比例1的ivt后的rna分别经过脂质纳米颗粒(lnp)包埋后，分别以3ug/动物的剂量经腹腔注射到小鼠体内(每组6只)。2小时、6小时以及24小时后分别收集小鼠的血清样本，并且利用elisa(enzyme linked immunosorbent assay，酶联免疫吸附测定)法测定小鼠体内α干扰素(ifnα)以及促红细胞生成素(epo)的水平，检测结果如表6、表7、图3和图4所示。
[0120]
表6小鼠体内ifnα的水平
[0121]
[0122]
从表6可以看出：实施例56及实施例59中小鼠体内ifnα的水平明显低于对比例1的中小鼠体内ifnα的水平，因此实施例56以及实施例59相对于对比例1可以显著降低dsrna引起的免疫原性。
[0123]
表7小鼠体内epo的水平
[0124][0125]
从表7可以看出：实施例56及实施例59中小鼠体内epo的水平明显高于对比例1的中小鼠体内epo的水平，因此实施例56以及实施例59相对于对比例1可以显著提高mrna的翻译效率，促进蛋白的表达。
[0126]
以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。