基于LAMP的核酸快速检测和单核苷酸多态性测定技术的制作方法

本发明涉及一种新型核酸快速检测和单核苷酸多态性测定技术，尤其涉及一种基于环介导的恒温扩增(lamp)技术的检测快速检测和单核苷酸多态性测定技术，可以用于检测核酸分子和基因的单核苷酸多态性，属于核酸检测。

背景技术：

1、核酸检测作为分子诊断的三大技术之一，发展最为迅速，具有巨大的市场容量。核酸检测技术不仅在科学研究上获得广泛的应用，在临床诊断、食品检测、法医鉴定等领域的重要性也越来越明显。现今的核酸检测技术种类多样，主要包括聚合酶链式反应(pcr)、等温核酸扩增技术、核酸杂交检测技术、核酸序列分析技术等。操作简单、检测时间短、检测通量与灵敏度高是基因检测的发展方向。

2、聚合酶链式反应技术(pcr)作为分子诊断的三大技术之一，也分子诊断技术中发展时间最长、最为成熟的技术。其中荧光定量pcr(qpcr)技术被认为是进行分子诊断的金标准，其诊断产品被广泛用于传染病、性病、肿瘤、遗传病、单核苷酸多态性的筛查检测，占据传染病检测大部分市场。但qpcr流程繁琐，需集中送检，耗时较长，无法实现4小时内出具报告，且对热循环仪的要求很高，需要在特定的pcr实验室中进行操作，操作人员也需持pcr证上岗，目前部分医疗机构并不具备核酸检测能力，县级医院建设pcr实验室也存在诸多困难和限制。

3、即时检测(poct，point-of-care testing)技术检测时长短，是体外诊断的发展需求，目前体外诊断的生化诊断和免疫诊断基本实现了poct。而分子诊断虽然准确灵敏，但无论qpcr、基因测序都不能实现poct检测，因此poct便捷快检技术是分子诊断行业未来的发展趋势。

4、lamp又称环介导等温扩增技术，针对靶基因的6个区域设计6条特异引物，在链置换dna聚合酶(bst dna聚合酶)的作用下，利用基因模板、引物、dntp等，在60-65℃进行恒温扩增，15-60分钟左右即可实现109～1010倍的核酸扩增。它是一种新型的核酸扩增方法，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点，是核酸快速检测的主要技术平台。若在反应体系中加入荧光探针分子和切割配对探针分子的酶，还可以实时监测lamp扩增产物量，对靶基因的扩增产物进行类似qpcr的定量分析。

5、分子信标(molecular beacon)是一种短的寡核苷酸单链构成的茎环结构，一端为荧光基团标记，另一端为淬灭基团标记。颈环结构的分子信标荧光基团和淬灭基团相互靠近，荧光基团被淬灭基团淬灭，不发射荧光。如果被检测的核酸分子能够与分子信标的单链环区域杂交，分子信标的茎结构遭到破坏，增加了荧光基团与淬灭基团之间的空间距离，荧光基团发出荧光信号。荧光信号的强弱依赖于被检测的dna分子的含量。由于分子信标不具有信号放大累积功能，因此直接用分子信标杂交检测目标核酸的技术，灵敏度很低。

6、taqman探针是一种短的寡核苷酸单链构成的茎环结构，一端为荧光基团标记，另一端为淬灭基团标记。荧光基团和淬灭基团距离很近，使得荧光基团不能发射出荧光。如果靶核酸分子与taqman探针杂交后，双链dna外切核酸酶把taqman探针末端水解，使得荧光基团能够发射出荧光信号。taqman探针发挥荧光定量作用，需要有双链dna外切核酸酶活性。然而常温核酸扩增技术中的大部分dna聚合酶不具有双链dna外切核酸酶活性，不能进行常规的taqman探针法荧光定量检测。

7、rnase hii是一种核糖核酸内切酶，能水解rna/dna杂交体系中的rna链。该酶不能消化单链或双链dna。rnase hii还能够水解只含有一个rna碱基的杂合双链dna-rn-dna/dna，因此其具有水解含一个rna碱基的分子信标和taqman探针，进行信号放大累积，克服常规分子信标和taqman探针不能够进行信号放大的的缺点。将切割型分子信标或taqman探针与lamp技术相偶联，使dna的恒温扩增的荧光定量检测成为了可能，为分子诊断的poct应用打下了基础。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种基于lamp和切割型分子信标或taqman探针的等温核酸荧光定量快检技术，克服常规杂交型分子信标或taqman探针检测技术不能进行信号放大的不足，lamp不能进行类似taq dna聚合酶催化的taqman探针法特异性检测的缺点。与传统lamp核酸扩增技术相比，本发明通过耐热核酸酶hii将中间带有一个核糖核苷酸的分子信标或taqman探针在中间切断，将荧光信号累积下来，达到信号放大的作用。该方法可以用于核酸检测和基因分型测定。本专利可以进行食品污染微生物、环境微生物、病原微生物等的核酸检测，基因突变的单核苷酸单体型检测等。

2、为实现这样的目的，在本发明中，分子信标或taqman探针的中间位置为一个核糖核苷酸，同时采用耐热核酸酶hii，可以与65度反应的lamp核酸扩增技术相偶联，不依赖于昂贵的qpcr仪，进行核酸等温指数扩增的荧光定量检测和单核苷酸多态性测定。

3、本发明的具体步骤如下：

4、第一步，制备中间带一个核糖核苷酸的分子信标或taqman探针。分子信标长37个核苷酸，中间带有一个核糖核苷酸，分子信标环上的核苷酸与靶标dna配对，两侧的6个核苷酸彼此配对，两侧分别用荧光发射基团和荧光淬灭基团标记，整个分子信标形成茎环结构，无荧光释放出来。荧光发射基团可以用fam，tet等，荧光淬灭基团可以用dacbyl等。taqman探针长20-30个核苷酸，中间含有1个rna碱基，两侧分别用荧光发射基团和荧光淬灭基团标记，荧光发射基团可以用fam、tet等，荧光淬灭基团可以用bhq1、dacbyl等，taqman探针无荧光释放出来。

5、第二步，lamp等温核酸扩增反应体系的建立。将扩增目标dna的引物序列、dntp、bst dna聚合酶大片段、检测样本dna、tth核酸酶hii、分子信标或taqman探针，加入lamp等温核酸扩增的反应体系中，配制反应混合物。

6、第三步，lamp扩增反应和荧光信号放大反应。将第二步的反应混合物在荧光定量pcr仪或便携式荧光检测仪中于65度保温一定时间，进行lamp等温核酸扩增和荧光信号释放反应。

7、第四步，确定靶核酸分子的浓度或单核苷酸多态性。根据荧光定量pcr仪的扩增曲线，或便携式荧光定量仪的最终荧光信号强度，确定检测样本是否含有靶核酸检测及其浓度。若进行单核苷酸多态性分型，则通过比较不同样本间荧光信号的差异，确定检测样本待测位点碱基的单核苷酸多态性。

8、本发明与现有的基于分子信标或常规的taqman探针的核酸检测和单核苷酸多态性的基因分型技术相比有显著的进步。主要优点如下：(1)分子信标或taqman探针中间带有一个核糖核苷酸，可以切断分子信标或taqman探针，永久释放并累积荧光信号。(2)核酸酶hii来源于耐热微生物，因此整个荧光信号的释放反应可以在65度下与lamp等温扩增技术相偶联，实现等温核酸荧光定量检测和单核苷酸多态性基因分型，并且检测样本dna可以是双链dna。(3)荧光信号的释放反应与lamp等温扩增反应的耦合检测，实现了恒温下核酸扩增与信号检测，克服了对荧光定量pcr的绝对依赖性，提高了靶核酸的检测灵敏度。