一种热稳定性反转录酶突变体基因、制备方法和应用与流程

本发明涉及生物工程，具体涉及一种热稳定性反转录酶突变基因、制备方法和应用。

背景技术：

1、dna聚合酶作为dna复制的核心蛋白，以dna为模板合成互补的dna链，完成基因组dna的复制和修复。dna聚合酶主要功能以dna单链作为模板，利用dntp作为原料催化合成新的互补dna。反转录酶本质上也是一种ｄｎａ聚合酶，只不过可以用rna作为模板，合成与rna互补的dna链（又称cdna链）。反转录酶在rna分子的检测与基因克隆方面有着重要应用。

2、反转录酶是一种特殊的dna聚合酶，既能够利用rna也能够利用dna为模板，合成互补的dna链。其中利用rna为模板时的dna聚合酶活性成为反转录酶。目前，常用的反转录酶为mmlv反转录酶，其具有很强的反转录酶活性，但热稳定较差。目前开发的一些热稳定性提高的反转录酶活性较低，需要开发热稳定性好、活性高的反转录酶。

3、dna与rna的检测在现在生命科学中具有广泛应用。例如，基于taq酶的dna扩增反应，在病毒、微生物等各种检测中具有各种应用。其中，rna检测不同于dna检测。绝大部分dna聚合酶只能以dna为模板进行dna合成；而rna的检测需要先把rna先转化为dna，才能够再利用taq dna聚合酶等来检测dna。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提出一种热稳定性反转录酶的突变基因、制备方法和应用，所述热稳定性反转录酶同时具有dna聚合酶活性与反转录酶活性，可在高温下应用于合成目的dna、将rna转录成dna。

2、本发明的技术方案是这样实现的：

3、本发明提供一种热稳定性反转录酶突变体，其氨基酸序列如序列表中序列1所示。

4、本发明进一步保护一种编码上述热稳定性反转录酶的突变基因，其核苷酸序列如序列表中序列2所示。

5、本发明进一步保护一种上述的热稳定性反转录酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

6、s1. 构建热稳定性反转录酶的重组表达载体；

7、s2. 将热稳定性反转录酶重组表达载体转入宿主细菌，并对宿主细菌进行扩大培养、诱导表达；

8、s3. 收集诱导培养后的菌体，进行破碎、离心，得到上清液；

9、s4. 对上清液进行纯化，得到所述热稳定性反转录酶。

10、本发明具有如下有益效果：本发明的热稳定性反转录酶具有高温稳定性，在65度仍具有活性，65度半衰期为1小时，可以在高温下以rna为模板链延伸dna，合成互补的dna链（cdna）。将热稳定性反转录酶在37-65度进行反转录反应，合成cdna，用于rna检测与cdna编码基因的克隆。高温下的反转录反应能够消除rna二级结构对cdna合成的抑制作用，提高反转录反应合成cdna的长度和速度。

技术特征：

1.一种热稳定性的反转录酶，其氨基酸序列如序列表中序列1所示。

2.一种编码权利要求1所述热稳定性反转录酶突变基因，其核苷酸序列如序列表中序列2所示。

3.一种如权利要求1所述的热稳定性反转录酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

技术总结
本发明提出了一种具有热稳定性的反转录酶突变体的制备方法和应用，所述反转录酶为定向进化获得的突变体蛋白，该反转录酶突变体具有很高的热稳定性，同时具有和野生型反转录酶相当的酶活性。本发明的反转录酶可以用于以RNA为模板，合成互补的DNA链（cDNA）。将其克隆到pET28表达载体，在大肠杆菌中诱导表达，经固定化镍离子亲和纯化，制备反转录酶。将其用于反转录反应，合成cDNA，进行RNA检测与cDNA编码基因的克隆。

技术研发人员：金正,刘心菲
受保护的技术使用者：苏州拜科生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15