一种正调控水稻抗性的类受体蛋白激酶OsIFBR1

一种正调控水稻抗性的类受体蛋白激酶osifbr1
技术领域
1.本发明涉及分子生物技术领域，尤其涉及一种正调控水稻抗性的类受体蛋白激酶osifbr1。


背景技术：

2.水稻是我国最重要的粮食作物之一，水稻的高产稳产对保障经济发展和社会稳定具有重要意义。白叶枯病是由黄单胞杆菌水稻致病变种(xanthomonas oryzae pv.oryzae)引起的细菌性枯萎病，是世界上对水稻危害最大的一种细菌性病害，一般可致水稻减产20％-30％左右，严重可达50％，发病范围遍及世界各稻区，在亚洲地区尤为严重，在我国华南稻区危害较为严重。稻瘟病是由稻梨孢病菌(pyricularia oryzae)引起的真菌性病害，可引发大幅度减产，严重时减产40％～50％，甚至颗粒无收。该病为通过气流传播的流行病，对水稻生产威胁极大，危害程度因品种、栽培技术以及气候条件不同有差别，世界各稻区均有发生，其中以叶部、节部发生为多，发生后可造成不同程度减产，尤其穗颈瘟或节瘟发生早而重，可造成白穗以致绝产。目前在农业生产中，防治这两种病害的主要手段是利用抗病品种，然而病原菌毒性的变异，经常造成品种抗性的丧失。因此，培育广谱的抗病品种迫在眉睫。近年来转基因技术因其周期短、效率高而被广泛应用于水稻育种，挖掘水稻稻瘟病和白叶枯病的抗性相关基因，利用转基因育种技术改变抗性相关基因表达，对稻瘟病和白叶枯病的种质资源创制和有效防控具有重要意义。
3.类受体激酶(receptor-likekinases，rlks)是植物中广泛存在的一类跨膜蛋白激酶，影响植物的生长发育、种子萌发、光形态建成，以及对生物胁迫和非生物胁迫的响应。一般rlks由胞内区(cytoplasmic domain，cd)、跨膜区(transmembrane domain，tm)和胞外区(extracellular domain)三部分组成。往往通过细胞外结构域识别病原物的相关分子模式，激活下游免疫反应，例如活性氧(reactive oxygen species,ros)爆发，病程相关基因(pathogenesis-related gene,pr)表达增强等，来抵御病原物的侵染。水稻基因组中编码rlks的基因高达1131个，大部分rlks的功能尚不清楚，其中osifbr1的编码基因与水稻稻瘟病和白叶枯病抗性之间的关系尚未见报道。


技术实现要素：

4.针对现有技术中的上述不足，本发明的目的在于提供osifbr1基因及编码蛋白在调控水稻稻瘟病和白叶枯病抗性中的应用，敲除所述osifbr1基因得到的突变体更易感病，通过超表达所述osifbr1基因得到的转基因植株更抗病，因此所述osifbr1基因可正向调控水稻对稻瘟病和白叶枯病的抗性。
5.为了达到上述发明目的，本发明采用的具体方案为：
6.一种正调控水稻抗性的类受体蛋白激酶osifbr1，其氨基酸序列如seq id no.1；
7.其核苷酸序列如seq id no.2；
8.所述基因osifbr1在防治稻瘟病和白叶枯病中的应用；
9.通过转基因方法在植物中过量表达所述基因。
10.作为改进，通过表达所述基因osifbr1的方法包括利用非特异性启动子csv表达osifbr1基因的cds序列。
11.作为改进，所述植物为水稻。
12.作为改进，所述抗病性为抗稻瘟病菌和白叶枯菌引起的植物病害。
13.作为改进，通过crispr/cas9技术敲除所述基因osifbr1，获得敲除突变体osifbr1；通过非特异性启动子csv表达osifbr1的cds序列获得过表达植株；osifbr1过表达(osifbr1ox)转基因植株对稻瘟病和白叶枯病表现为抗性增强。
14.本发明的有益效果为：
15.本发明提供了osifbr1基因在调控水稻对稻瘟病和白叶枯病抗性中的应用，通过crispr/cas9技术敲除所述基因osifbr1，获得敲除突变体osifbr1。通过稻瘟病和白叶枯病抗性鉴定发现，与野生型水稻相比，osifbr1突变体水稻更感病；通过非特异性启动子csv表达osifbr1的cds序列获得过表达植株，通过稻瘟病和白叶枯病抗性鉴定发现，与野生型相比，osifbr1过表达(osifbr1ox)转基因水稻更抗病，表明osifbr1正向调控水稻对稻瘟病和白叶枯病的抗性。osifbr1过表达(osifbr1ox)转基因植株对稻瘟病和白叶枯病表现为抗性增强，可推广实际应用。本发明有利于水稻广谱抗病品种的培育，为后期筛选高抗水稻品种提供依据。
附图说明
16.图1为利用crispr/cas9基因编辑技术在水稻日本晴(nip)背景中敲除所述基因osifbr1，制备osifbr1突变体。
17.图2为osifbr1突变体对稻瘟病的抗性分析，其中a表示野生型日本晴(nip)和osifbr1突变体接种稻瘟病菌后的表型；b表示野生型日本晴(nip)和osifbr1突变体接种稻瘟病菌后，叶片中稻瘟病菌的菌量检测结果。
18.图3为osifbr1突变体对白叶枯病的抗性分析，其中a表示野生型日本晴(nip)和osifbr1突变体接种白叶枯病菌后的表型；b表示野生型日本晴(nip)和osifbr1突变体接种白叶枯病菌后的病斑长度测量结果。
19.图4为过表达转基因植株osifbr1ox的制备，其中a表示过表达osifbr1基因的载体结构；b表示野生型日本晴(nip)和过表达转基因植株osifbr1ox中osifbr1表达水平检测结果。
20.图5为过表达转基因植株osifbr1ox对稻瘟病的抗性分析，其中a表示野生型日本晴(nip)和过表达转基因植株osifbr1ox接种稻瘟病菌后的表型；b表示野生型日本晴(nip)和过表达转基因植株osifbr1ox接种稻瘟病菌后，叶片中稻瘟病菌的菌量检测结果。
21.图6为过表达转基因植株osifbr1ox对白叶枯病的抗性分析，其中a表示野生型日本晴(nip)和过表达转基因植株osifbr1ox接种白叶枯病菌后的表型；b表示野生型日本晴(nip)和过表达转基因植株osifbr1ox接种白叶枯病菌后的病斑长度测量结果。
具体实施方式
22.下面结合附图来进一步说明发明的具体实施方式，但本发明不仅仅限于以下实施
例。在本发明的范围内或者在不脱离本发明的内容、精神和范围内，对本发明进行的变更、组合或替换，对于本领域的技术人员来说是显而易见的，且包含在本发明的范围之内。
23.一种正调控水稻抗性的类受体蛋白激酶osifbr1，由1019个氨基酸组成，其氨基酸序列如seq id no.1
24.(mavynililflllllfslstaqpsadeqklllaikqdwdnpaplsswsstgnwtgvissstgqvtglslpslhiarpipasvcslknltyidlscnnltgdfptvlygcsalefldlsnnqlsgrlpdridrlslgmqhlnlssnaftgdvpsaiarfsklkslvldtnrfngnypgaaigglveletltlasnpfepgpvpkefgkltklkmlwlswmnltgtipddlsslmeltlldlsqnkmqgqipewvlkhqklenlylyasnlsgeigpnitalnlqeldlsmnkfsgsipedianlkklrllylyynnltgpipagvgmmpdltdirlfnnklsgplpaelgkhselgnfevsnnnlsgelpdtlcfnkklfdivvfnnsfsgvfptnlgdcktinnimaynnhfvgdfpkkiwsfelltnvmiynnnftgtlpseisfnisriemennrfsgalpstavglksftaennqfsgelpadmsrlanltelnlagnqlsgsippsiksltsltslnlsrnqisgeipaavgwmglyildlsdngltgdipqdfsnlhlnflnlssnqlsgevpetlqngaydrsflgnhglcatvntnmnlpacphqshnksstnliivfsvltgvvfigavaiwlliirhqkrqqdlagwkmtpfrtlhfsecdvlgnlheenvigsggsgkvyriniggkgsdgmvvavkrlwrtaaksdaksdkefdaevrilgevshiniidllccisgddtkllvyeymengsldrwlhrrddggaptaplqwptrlciaidaarglsymhhecaqpimhrdvkssnilldpafrakiadfglarilaksgepnsisaiggtfgymapeygcrakvnekvdvyafgvvllelttgrvandggadwclaewawrrykaggelhdvvdeaiqdraafledavavfllgmictgddpasrptmkevleqlvqydrtssvaaacrddsggapslskgkkdgkgksssagttagkmwgagtgdeesgsfvahpv)所示。
25.本发明提供了一种正调控水稻抗性的基因osifbr1，由3060个核苷酸组成，其核苷酸序列如seq id no.2
26.(atggctgtctacaacatcctcatcctctttctactactattgctcttctctctatcgactgcgcagcccagcgccgacgagcaaaaactactcctagcaatcaagcaagattgggacaacccagctccactcagttcatggagcagcaccggcaactggactggtgttatcagtagcagcacaggtcaggtcactggcctctccttgccaagtctccatatagccagaccaatcccagcctccgtttgtagcctcaagaatctgacctacatagacctctcttgcaacaatctcaccggtgatttccccacggtgctctacggttgctcagctttggagttccttgacctatccaacaatcaattatccggcagacttccggaccgcattgacaggctatcgttggggatgcaacacctcaacctgtccagcaatgctttcaccggcgatgtgccgtcggctattgcaaggttctcgaagctcaagtcattggtccttgacactaatagattcaatgggaattacccgggtgccgccattggaggccttgtggagcttgagacgctgacgttggcatccaacccattcgagccgggtccagtcccaaaggagtttggcaagctgacaaagctgaaaatgctgtggctgtcatggatgaaccttactgggaccatccctgatgatctgtcgtcattgatggagctcacattgttggacttgtcacaaaataagatgcagggacaaatccccgagtgggtattgaagcaccagaagctcgagaatctatatctctatgcaagcaatttgagtggcgagattggtcctaacatcacagctctcaacctgcaggagcttgacctgtccatgaacaagttctctggatcaataccagaggacattgcaaacttgaagaagttgagattactatatttgtactacaacaatctcactggacccatcccggctggtgttggtatgatgccggacctcaccgacatccgtctcttcaataacaagctctctgggcccctacccgcggagcttggaaaacattcagaattggggaattttgaggtgtccaacaacaacctctctggtgagctaccggatacactttgcttcaataagaagctctttgacattgtggtgttcaacaatagcttctccggcgtgttcccgacgaaccttggggattgcaaaaccatcaacaacatcatggcatacaacaaccactttgttggggactttcccaagaagatatggtcattcgagttgctcaccaatgtcatgatttacaacaacaacttcaccggcactctacccagtgagatatcatttaacatctcgaggattgagatggagaacaatcgcttctccggtgccctcccgtcgaccgccgtcggtctgaagagtttcacggcggagaacaaccagt
tctccggtgaactgccagctgacatgtctaggcttgccaacctcaccgagttgaacctcgccggcaaccagttatccggctcgattccgccgtctatcaaatcattgacaagtctgacctccctcaaccttagcagaaaccagatttccggtgagatccctgccgcagtcgggtggatgggcctctacattcttgacctctccgacaacgggctcaccggcgacatacctcaagatttcagcaatctccatctcaactttctcaacctttcttctaaccagctctccggcgaggtcccggagacgctgcaaaacggcgcctacgatcgtagcttcctcggcaaccatggcctctgtgccacggtgaacacgaacatgaaccttccggcttgcccccaccaaagccacaacaaatcgtcgacgaacctgatcatcgtcttctcggtgctcaccggcgtcgtgttcatcggcgccgtcgccatctggttgctgatcatccgacaccagaagcgtcagcaagacctcgccgggtggaagatgacgccgttccgtaccctgcacttctccgaatgcgacgtgctcggcaatctccacgaggagaacgtgatcggtagcggcggctccggcaaggtgtaccgcatcaacatcggcggcaagggcagcgacggcatggtggtggcggtgaagcggctatggcggacggcggccaagtcggacgcgaagagcgacaaggagttcgacgccgaggtgaggatcctcggggaggtaagccacatcaacatcatcgacctcctctgctgcatctccggcgacgacaccaagctgctcgtctacgagtacatggagaacggcagcctcgaccggtggctgcaccgccgcgacgacggcggcgcgccgacggcgccgctccagtggccgacgcggctctgcatcgccatcgacgcggcgagggggctcagctacatgcaccacgagtgcgcgcagccgatcatgcaccgcgacgtcaagtccagcaacatcctgctcgacccggccttccgcgccaagatcgccgacttcggcctcgccaggatcctcgccaagtccggcgagccgaattccatctccgccatcggtggcaccttcggctacatggctccagagtacgggtgcagagcgaaggtgaacgagaaggtggacgtgtacgcgttcggcgtcgtgctgctggagctgacgacggggcgggtggcgaacgacggcggcgcggactggtgcctggcggagtgggcgtggcggcggtacaaggccggcggcgagctgcacgacgtcgtcgacgaggccatccaggacagggcggcgttcctggaggacgccgtggcggtgttcctgctcggcatgatctgcaccggcgacgacccggcgtcgcggccgacgatgaaggaggtgctcgagcagctggtccagtacgaccgtacgtccagcgtggcggccgcctgccgcgatgactccggcggcgcaccgtcgttatcgaaggggaagaaagacgggaaggggaagagctcgtcggcgggaacgacggccgggaaaatgtggggcgccggcaccggcgacgaggaaagcggcagtttcgtggcgcatccagtttaa)所示。
27.本发明利用crispr/cas9基因编辑技术敲除水稻中osifbr1基因，获得的突变体植株osifbr1。所述crispr/cas9系统优选包括1个敲除osifbr1基因的sgrna。osifbr1基因的敲除靶点优选为：靶点(target)核苷酸序列为：gtcaatgatttgatagacgg(seq id no.3，最后三个碱基为pam位点)。相较于野生型日本晴植株，突变体植株osifbr1，更易感稻瘟病和白叶枯病；本发明过表达所述osifbr1基因获得转基因水稻植物(osifbr1ox)，相较于野生型日本晴植株，更抗水稻稻瘟病和白叶枯病，所以osifbr1基因正调控水稻对稻瘟病和白叶枯病的抗性。
28.本发明还提供了过表达osifbr1基因的转基因植物在增强水稻稻瘟病和白叶枯病抗性中的应用，所述osifbr1基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。本发明对所述过表达osifbr1基因的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规过表达方法即可。在本发明实施例中，优选通过非特异性启动子csv表达osifbr1 cds序列获得过表达植株。
29.下面结合实施例对本发明提供的osifbr1基因及编码蛋白在调控水稻抗病性中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
30.实施例1
31.1、利用crispr/cas9基因编辑技术构建osifbr1基因突变体
32.利用http://skl.scau.edu.cn/网站，对目的基因osifbr1进行编辑靶点的设计，靶点位置如图1所示，其中靶点核苷酸序列为：gtcaatgatttgatagacgg(seq id no.3，最后
三个碱基为pam位点)。将候选靶点序列插入中间载体pos-sgrna中，随后通过golden gate克隆方式，利用bsai酶切位点将osu6a-target-sgrna片段插入到最终载体ph-ubi-cas9中(具体构建步骤参考文献：miao jin,guo dongshu,zhang jinzhe,et al.targeted mutagenesis in rice using crispr-cas system.cell research,23(10):1233
–
1236.)。将构建成功的crispr/cas9载体，通过农杆菌介导的方法，转化至野生型日本晴的幼胚诱导的愈伤组织中，经潮霉素筛选获得阳性转基因植株。
33.2、对上述获得的阳性转基因植株编辑形式进行分子鉴定
34.以水稻叶片的基因组dna为模板，用如下鉴定引物进行pcr扩增，对扩增产物进行sanger测序，解析突变体编辑形式。
35.osifbr1突变体鉴定引物为：
36.osifbr1-check-f(seq id no.4)：attgtggtgttcaacaatagct；
37.osifbr1-check-r(seq id no.5)：cacgttctcctcgtggagat。
38.pcr扩增体系根据2
×
es taq mastermix(dye)使用说明书配制，具体为：2
×
es taq mastermix(dye)10μl，上游引物(10μm)0.8μl，下游引物(10μm)0.8μl，dna模板1μg，ddh2o补至20μl。
39.pcr反应体系为：94℃预变性2min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，循环32次；72℃延伸2min。
40.结果如图1所示，获得1个纯合敲除突变体株系osifbr1。在osifbr1中，osifbr1基因起始密码子atg下游1528bp处插入一个碱基a，产生移码突变，导致了1567-1569bp处提前形成了终止密码子。然后从纯合敲除体的后代中筛选出不含cas9基因的植株用于后续实验。
41.3、野生型日本晴(nip)和敲除突变体osifbr1接种稻瘟病菌后表型观察：采用喷雾接种法进行抗性鉴定。
42.将野生型日本晴(nip)和敲除突变体osifbr1种植于苗盘中，待其生长至四叶期进行接菌。将保存在滤纸上的稻瘟病菌s5菌株接种于番茄燕麦固体培养基平板上活化。刮取菌丝转至新的番茄燕麦培养基平板上扩大培养。将菌丝进行涂断，放置26℃黑光灯培养箱中诱导产孢。用0.1％吐温涂洗平板，过滤后，将孢子浓度调至1
×
105个/ml。用喷壶均匀喷洒在水稻苗叶片上，接种后黑暗保湿培养24小时，后撤去遮光布，继续正常光照培养，接种7天后进行拍照记录发病情况。同时利用实时荧光定量pcr检测发病叶片的带菌量，取等量的野生型日本晴(nip)和敲除突变体osifbr1的叶片，提取基因组dna，用如下引物进行荧光定量pcr，比较日本晴与突变体osifbr1叶片所携带的稻瘟菌量，从而完成敲除突变体的抗稻瘟病评价。
43.实时荧光定量pcr引物为：
44.mopot2-f(seq id no.6)：acgacccgtctttacttatttgg；
45.mopot2-f(seq id no.7)：aagtagcgttggttttgttggat；
46.osubi-f(seq id no.8)：gcccaagaagaagatcaagaac；
47.osubi-r(seq id no.9)：agataacaacggaagcataaaagtc。
48.荧光定量pcr扩增体系根据2
×
sybr qpcr mixture使用说明书配制，具体为：2
×
sybr qpcr mixture 10μl，上游引物(10μm)2μl，下游引物(10μm)2μl，dna模板1μg，ddh2o补
至20μl。
49.荧光定量pcr反应体系为：95℃预变性10min；95℃变性30s，60℃退火1min，循环40次；72℃延伸2min。
50.结果如图2所示，相较于野生型，osifbr1突变体对稻瘟病的抗性显著降低，表现为osifbr1突变体叶片中的稻瘟菌量显著高于野生型。
51.4、野生型日本晴(nip)和敲除突变体osifbr1接种白叶枯菌后表型观察：采用剪叶接种法进行抗性鉴定。
52.将野生型日本晴(nip)和敲除突变体osifbr1种植于桶中，待其生长至抽穗期进行接菌。将白叶枯病菌pxo99a菌株划线于牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上活化。挑取单菌落至牛肉膏蛋白胨液体培养基，28℃摇培过夜后，收集菌体，将活化的菌液浓度调至od600约为0.8，用剪刀蘸取菌液后，选取倒二叶，沿叶片末端剪口接菌，注意对接菌的水稻喷水保湿，每个株系至少接种20个叶片，接种14天后进行拍照记录发病情况并测量病斑长度。
53.结果如图3所示，相较于野生型，osifbr1突变体对白叶枯病的抗性显著降低，表现为osifbr1突变体株系叶片上的病斑长度显著长于野生型植株。
54.实施例2
55.1、构建osifbr1基因过表达植株osifbr1ox
56.提取野生型日本晴的rna，反转录为cdna。以此cdna为模板，用如下引物进行pcr扩增，得到长度为3076bp的pcr产物，两端分别包含xbai和bamhi的酶切位点。该pcr产物具有seq id no：2所示序列的1至3060位核苷酸。
57.osifbr1-f(seq id no.10)：gctctagaatggctgtctacaacatcct；
58.osifbr1-r(seq id no.11)：cgggatccaactggatgcgccacgaaa。
59.(引物中小写碱基为酶切位点以及保护碱基)
60.pcr扩增体系根据phusion dna polymerase使用说明书配制，具体为：2
×
phanta max buffer 10μl，dntp mix 0.4μl，上游引物(10μm)0.8μl，下游引物(10μm)0.8μl，cdna模板400ng，phusion dna polymerase 0.4μl，ddh2o补至20μl。
61.pcr反应体系为：95℃预变性3min；95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸90s，循环32次；72℃充分延伸5min。
62.用xbai和bamhi酶切该pcr产物，得到的酶切产物与经过同样酶切的pcsv1300载体骨架进行连接，使pcr产物插入pcsv1300载体的xbai和bamhi位点间，得到最终载体。
63.经过测序，该重组载体为将seq id no:2所述序列自第1位至3060位核苷酸插入pcsv1300载体的xbai和bamhi酶切位点间，为osifbr1过表达载体，如图4a所示。
64.将构建成功的pcsv1300-osifbr1载体转化至野生型日本晴的幼胚诱导的愈伤组织中，通过潮霉素筛选获得阳性转基因植株。
65.2、对上述获得的阳性转基因植株进行分子鉴定
66.提取野生型日本晴和osifbr1过表达转基因植株的rna，反转录为cdna。以此cdna为模板，用如下引物进行实施例1中相同的荧光定量pcr。
67.qrt-osifbr1-f(seq id no.12)：atggctgtctacaacatcctcatcc；
68.qrt-osifbr1-r：(seq id no.13)：aactggatgcgccacgaaac；
69.qrt-osact1-f(seq id no.14)：ctcccccatgctatccttcg；
70.qrt-osact1-r(seq id no.15)：tgaatgagtaaccacgctccg。
71.结果如图4b所示，过表达植株osifbr1ox中osifbr1的平均相对表达水平明显高于野生型日本晴中osifbr1的表达水平。
72.3、野生型日本晴(nip)和过表达植物osifbr1ox接种稻瘟病菌后表型观察：采用喷雾接种法进行抗性鉴定。
73.将野生型日本晴(nip)和过表达植物osifbr1ox种植于苗盘中，待其生长至四叶期进行接菌。将保存在滤纸上的稻瘟病菌s5菌株接种于番茄燕麦固体培养基平板上活化。刮取菌丝转至新的番茄燕麦培养基平板上扩大培养。将菌丝进行涂断，放置26℃黑光灯培养箱中诱导产孢。用0.1％吐温涂洗平板，过滤后，将孢子浓度调至1
×
105个/ml。用喷壶均匀喷洒在水稻苗叶片上，接种后黑暗保湿培养24小时，后撤去遮光布，继续正常光照培养，接种7天后进行拍照记录发病情况。同时利用实时荧光定量pcr检测发病叶片的带菌量，取等量的野生型日本晴(nip)和过表达植物osifbr1ox的叶片，提取基因组dna，以此为模板进行实施例1中相同的荧光定量pcr，比较日本晴与过表达植物osifbr1ox叶片所携带的稻瘟菌量，从而完成过表达植物osifbr1ox的抗稻瘟病评价。
74.结果如图5所示，相较于野生型，过表达植物osifbr1ox对稻瘟病的抗性显著增强，表现为过表达植物osifbr1ox叶片中的稻瘟菌量显著低于野生型。
75.4、野生型日本晴(nip)和过表达植物osifbr1ox接种白叶枯菌后表型观察：采用剪叶接种法进行抗性鉴定。
76.将野生型日本晴(nip)和过表达植物osifbr1ox种植于桶中，待其生长至抽穗期进行接菌。将白叶枯病菌pxo99a菌株划线于牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上活化。挑取单菌落至牛肉膏蛋白胨液体培养基，28℃摇培过夜后，收集菌体，将活化的菌液浓度调至od600约为0.8，用剪刀蘸取菌液后，选取倒二叶，沿叶片末端剪口接菌，注意对接菌的水稻喷水保湿，每个株系至少接种20个叶片，接种14天后进行拍照记录发病情况并测量病斑长度。
77.结果如图6所示，相较于野生型，过表达植物osifbr1ox对白叶枯病的抗性显著增强，表现为过表达植物osifbr1ox叶片上的病斑长度显著短于野生型植株。
78.以上所述仅为本发明专利的较佳实施例而已，并不用以限制本发明专利，凡在本发明专利的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明专利的保护范围之内。