一种产医蛭透明质酸酶的重组毕赤酵母及其构建方法与流程

本发明涉及一种产医蛭透明质酸酶的重组毕赤酵母及其构建方法，属于基因工程。

背景技术：

1、透明质酸酶(hyaluronidases，hyals)是一类降解透明质酸(ha)的糖苷酶的总称。由于能够加快药物吸收、辅助局部浸润麻醉和肿瘤治疗，hyals在医学上被广泛应用。根据其催化机制和反应产物不同，hyals家族分为三类：第一类是ha 4-糖苷水解酶(ec3.2.1.35)，主要存在于哺乳动物体内以及蜜蜂、蛇、蝎子等毒液中，水解ha的β-1,4糖苷键生成四糖(ha4)为主要水解产物，产物还原端为glcnac，同时也能水解软骨素类多糖且具有转糖苷作用，导致它们的水解产物分子量分布范围广；第二类为ha 3-糖苷水解酶(ec3.2.1.36)，主要存在于环节动物水蛭及一些甲壳动物，水解切割ha的β-1,3糖苷键生成的水解终产物为ha4和ha6，产物还原端为glcua，其中水蛭透明质酸酶具有高度的底物专一性且无转糖苷作用，产物的分子量分布窄；第三类是ha裂解酶(ec 4.2.2.1)，主要存在于链球菌、微球菌、梭菌等微生物中，以β-消除裂解方式切割ha的β-1,4糖苷键，产生不饱和双糖“葡糖醛酸-n-乙酰己糖胺”。

2、目前已表征的hyals大多来源于动物昆虫毒液(如lizard、snake、stonefish、lionfish、bee)、动物组织(如leech、bovine testicular、human testicular)以及微生物(如streptococcus spp.、streptomyces spp.、bacteroides spp.、vibrio spp.)。其中属于糖苷水解酶79(gh79)家族的水蛭透明质酸酶具有比酶活高(1.2×106u/mg)、产量高(2.12×106u/ml)、反应条件温和(最适温度45℃和最适ph 6.5)、水解产物分子量分布范围窄(多分散性指数约1.16)的优势，在制备特定分子量功能性ha寡糖方面具有重要应用价值。

3、毕赤酵母pichia pastoris gs115具有生长速度快、遗传操作简单、分泌效率高、对外源蛋白进行糖基化修饰的优点，是实现重组酶高水平分泌表达的常用真核表达系统。因此，实现mhyal在毕赤酵母中活性分泌表达具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明提供了一种编码医蛭透明质酸酶的基因，核苷酸序列如seq id no.1所示。

2、本发明还提供了携带所述基因的重组质粒。

3、在一种实施方式中，所述质粒包括但不限于ppic9k。

4、本发明还提供了携带所述基因或所述重组质粒的细胞系。

5、本发明还提供了一种产医蛭透明质酸酶的重组毕赤酵母，所述重组毕赤酵母携带上述基因或上述重组质粒。

6、在一种实施方式中，所述重组毕赤酵母以毕赤酵母gs115为宿主，以ppic9k为载体。

7、本发明还提供一种产医蛭透明质酸酶的方法，是将所述重组毕赤酵母在发酵培养基中，于28～32℃、200～250rpm进行发酵表达。

8、在一种实施方式中，所述发酵培养基为bmmy培养基。

9、在一种实施方式中，发酵过程中每20～24h添加甲醇诱导表达。

10、在一种实施方式中，所述方法是将单菌落接种于ypd培养基中，于30℃、200rpm培养过夜，获得种子培养物；将种子培养物转移至bmmy培养基中，于30℃、200rpm培养96h，每隔24h按终浓度1％(v/v)补充甲醇。

11、本发明还提供所述重组毕赤酵母在水解糖胺聚糖中的应用。

12、在一种实施方式中，所述糖胺聚糖包括透明质酸(ha)、肝素(hp)或硫酸软骨素(cs)。

13、在一种实施方式中，所述硫酸软骨素包括a型硫酸软骨素(csa)和c型硫酸软骨素(csc)。

14、有益效果：

15、1、本发明将来源于医蛭hirudo medicinalis的基因mhyal的核苷酸序列进行优化，并利用毕赤酵母p.pastoris gs115进行表达，成功得到目的基因高拷贝转化子，命名为p.pastoris-ppic9k-mhyal。

16、2、本发明利用p.pastoris-ppic9k-mhyal进行摇瓶发酵制得发酵液，测定发酵液对不同糖胺聚糖底物ha、hp、csa和csc的水解活性，结果显示mhyal对不同糖胺聚糖底物ha、hp、csa和csc均有水解活性，其中对csa的水解活性最高，达到了14.9u/l，分别是csc、ha和hp的2.3、3.6和5.4倍。

技术特征：

1.一种编码医蛭透明质酸酶的基因，其特征在于，核苷酸序列如seq id no.1所示。

2.携带权利要求1所述基因的重组质粒。

3.携带权利要求1所述基因或权利要求2所述重组质粒的细胞系。

4.一种产医蛭透明质酸酶的重组毕赤酵母，其特征在于，所述重组毕赤酵母携带权利要求1所述基因或权利要求2所述重组质粒。

5.根据权利要求4所述的重组毕赤酵母，其特征在于，所述重组毕赤酵母以毕赤酵母gs115为宿主，以ppic9k为载体。

6.一种产医蛭透明质酸酶的方法，其特征在于，是将权利要求4或5所述重组毕赤酵母在发酵培养基中，于28～32℃、200～250rpm发酵培养，发酵过程中每20～24h添加甲醇诱导表达。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基为bmmy培养基。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法是将单菌落接种于ypd培养基中，于30℃、200rpm培养过夜，获得种子培养物；将种子培养物转移至bmmy培养基中，于30℃、200rpm培养96h，每隔24h按终浓度1％补充甲醇。

9.权利要求4或5所述重组毕赤酵母在水解糖胺聚糖中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述糖胺聚糖包括透明质酸、肝素或硫酸软骨素。

技术总结
本发明公开了一种产医蛭透明质酸酶的重组毕赤酵母及其构建方法，属于基因工程技术领域。本发明将来源于医蛭Hirudo medicinalis的基因mhyal的核苷酸序列进行优化，并利用毕赤酵母P.pastoris GS115进行表达，成功得到目的基因高拷贝转化子，命名为P.pastoris‑pPIC9K‑mhyal，进行摇瓶发酵制得发酵液，测定发酵液对不同糖胺聚糖底物HA、HP、CSA和CSC的水解活性，结果显示MHyal对不同糖胺聚糖底物HA、HP、CSA和CSC均有水解活性。本发明提供的重组毕赤酵母具有广阔的应用前景。

技术研发人员：康振,杜养标,庞博,袁明来,李江华
受保护的技术使用者：江苏瑞霆生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12