具有增强的L-精氨酸或L-瓜氨酸生产力的棒状杆菌属微生物及其相关方法与流程

本公开内容涉及具有提高的l-精氨酸或l-瓜氨酸生产力的棒状杆菌属(corynebacterium sp.)微生物以及使用其产生l-精氨酸或l-瓜氨酸的方法。

背景技术：

1、已知精氨酸以游离状态包含于植物等中。精氨酸是一种非必需氨基酸，但在成长中的儿童中以及在例如压力、创伤和癌症的特定情况下，它被认为是必须要提供的半必需氨基酸，并被广泛用作用于氨基酸补充剂、药物、食品等的组分。对于药物，精氨酸用于肝功能促进剂、脑功能促进剂、男性不育治疗剂、氨基酸综合制剂等中；以及对于食品，精氨酸用作鱼饼(fish cake)添加剂、健康饮料添加剂和用于高血压患者的盐替代品。

2、瓜氨酸是一种非必需氨基酸，并且已知瓜氨酸具有有用的作用，例如促进氨代谢、通过血管舒张改善血流、降低血压、神经传递、增强免疫力以及清除活性氧物质。在肾中，瓜氨酸被代谢为精氨酸，由此产生一氧化氮(no)。即，瓜氨酸在体内不是构成蛋白质的氨基酸，而是尿素循环的中间体之一，并且由精氨酸与被称为具有血管舒张作用的物质的no一起产生。另外，瓜氨酸与天冬氨酸缩合并再生为精氨酸。

3、这样的精氨酸和瓜氨酸的产生可使用天然存在的野生型菌株或从野生型菌株修饰以具有提高的精氨酸或瓜氨酸生产力的突变体菌株来进行。最近，为了提高精氨酸或瓜氨酸的产生效率，基因重组技术已经被用于例如大肠杆菌(escherichia coli)和棒状杆菌(corynebacterium)的微生物。在微生物中的l-精氨酸的生物合成中，l-谷氨酸被用作起始物质，并被依次转化成n-乙酰谷氨酸、n-乙酰谷氨酰基-p、n-乙酰谷氨酸5-半醛、n-乙酰鸟氨酸、l-鸟氨酸、l-瓜氨酸和精氨琥珀酸，从而合成l-精氨酸。在这种逐步合成过程中涉及多种蛋白质，例如酶、转录因子和转运蛋白。因此，可通过基因重组技术通过调节参与l-精氨酸或l-瓜氨酸生物合成的多种蛋白质的活性来提高l-精氨酸或l-瓜氨酸生产力，并且为了开发具有优异的l-精氨酸或l-瓜氨酸生产力的重组菌株或突变体菌株，需要进行许多研究。

4、[现有技术文献]

5、[专利文献]

6、韩国专利no.10-2269637

技术实现思路

1、本公开内容的一个目的是提供具有提高的l-精氨酸或l-瓜氨酸生产力的棒状杆菌属突变体菌株。

2、本公开内容的另一个目的是提供使用所述突变体菌株产生l-精氨酸或l-瓜氨酸的方法。

3、本公开内容的一个方面提供了通过具有增强的乙酰鸟氨酸氨基转移酶活性而具有提高的l-精氨酸或l-瓜氨酸生产力的棒状杆菌属突变体菌株。

4、本公开内容中使用的“乙酰鸟氨酸氨基转移酶”用于催化l-精氨酸生物合成途径中使n-乙酰谷氨酸5-半醛转化成n-乙酰鸟氨酸的反应。n-乙酰鸟氨酸通过多种酶依次转化成其他物质，并且作为结果，合成为l-精氨酸或l-瓜氨酸。

5、根据本公开内容的一个实施方案，乙酰鸟氨酸氨基转移酶可来源于棒状杆菌属微生物。

6、更具体地，棒状杆菌属微生物可以是谷氨酸棒状杆菌(corynebacteriumglutamicum)、corynebacterium crudilactis、沙漠棒状杆菌(corynebacteriumdeserti)、帚石南棒状杆菌(corynebacterium callunae)、corynebacteriumsuranareeae、corynebacterium lubricantis、corynebacterium doosanense、有效棒状杆菌(corynebacterium efficiens)、corynebacterium uterequi、停滞棒状杆菌(corynebacterium stationis)、corynebacterium pacaense、单一棒状杆菌(corynebacterium singulare)、corynebacterium humireducens、海洋棒状杆菌(corynebacterium marinum)、耐盐棒状杆菌(corynebacterium halotolerans)、企鹅棒状杆菌(corynebacterium spheniscorum)、corynebacterium freiburgense、纹状棒状杆菌(corynebacterium striatum)、犬棒状杆菌(corynebacterium canis)、产氨棒状杆菌(corynebacterium ammoniagenes)、牛肾盂炎棒状杆菌(corynebacterium renale)、corynebacterium pollutisoli、汉氏棒状杆菌(corynebacterium imitans)、黑海棒状杆菌(corynebacterium caspium)、龟口腔棒状杆菌(corynebacterium testudinoris)、corynebacaterium pseudopelargi或微黄棒状杆菌(corynebacterium flavescens)，但不限于此。

7、本文使用的术语“增强的活性”意指编码目的蛋白质例如酶、转录因子和转运蛋白的基因的表达已经被新引入或已经提高，使得该蛋白质的表达水平与在野生型菌株或修饰之前的菌株中的那些相比有所提高。术语“增强的活性”还包括：通过编码基因的核苷酸序列中的一个或更多个核苷酸的替换、插入、缺失或其组合，与由微生物最初具有的蛋白质活性相比，蛋白质本身的活性已提高的情况；由于编码酶的基因的表达或翻译提高，细胞中的酶的整体活性高于野生型菌株或修饰之前的菌株的那些的情况；及其组合。

8、根据本公开内容的一个实施方案，乙酰鸟氨酸氨基转移酶活性的增强可通过在编码乙酰鸟氨酸氨基转移酶的基因中进行定点突变来实现。

9、根据本公开内容的一个实施方案，编码乙酰鸟氨酸氨基转移酶的基因可由seq idno:1的核苷酸序列表示，或者可由seq id no:2的氨基酸序列组成。

10、根据本公开内容的一个实施方案，定点突变可以是seq id no:1的核苷酸序列中的一个或更多个核苷酸的替换。

11、根据本公开内容的一个实施方案，定点突变可以是seq id no:2的氨基酸序列中的一个或更多个氨基酸的替换。

12、更具体地，定点突变可以是在seq id no:2的氨基酸序列中位置50至200或100至150处的一个、两个、三个、四个或五个氨基酸的连续或非连续替换。

13、根据本公开内容的一个实施方案，定点突变可以是在seq id no:2的氨基酸序列中氨基酸位置131处的苏氨酸对丙氨酸的替换。

14、本文中使用的术语“提高的生产力”意指l-精氨酸或l-瓜氨酸生产力与亲本菌株中的l-精氨酸或l-瓜氨酸生产力相比有所提高。本文中使用的术语“亲本菌株”是指野生型菌株或待突变的突变体菌株，并且包括待直接突变或待用重组载体等转化的菌株。在本公开内容中，亲本菌株可以是野生型棒状杆菌属微生物或从野生型微生物突变而来的微生物或菌株。

15、如上所述，根据本公开内容的具有提高的l-精氨酸或l-瓜氨酸生产力的棒状杆菌属突变体菌株包含编码乙酰鸟氨酸氨基转移酶的基因的突变的核苷酸序列或氨基酸序列，并且因此与亲本菌株相比表现出提高的l-精氨酸或l-瓜氨酸生产力。特别地，棒状杆菌属突变体菌株的l-精氨酸或l-瓜氨酸生产力比亲本菌株的l-精氨酸或l-瓜氨酸生产力高至少5％，特别地5％至80％、10％至70％、20％至60％或30％至50％。

16、根据本公开内容的一个实施方案，棒状杆菌属突变体菌株可以是谷氨酸棒状杆菌。

17、根据本公开内容的一个实施方案的棒状杆菌属突变体菌株可通过重组载体获得，所述重组载体包含具有亲本菌株中的乙酰鸟氨酸氨基转移酶序列的一部分被替换的变体。

18、本文中使用的术语“部分”不是意指核苷酸序列、多核苷酸序列或氨基酸序列的全部，而是可以是1至300，优选1至100，更优选1至50，但不限于此。

19、本文中使用的术语“变体”是指由于在氨基酸序列的n端、c端和/或在氨基酸序列中的一个或更多个氨基酸的保守替换、缺失、修饰或添加而不同于突变之前编码蛋白质的特定基因的氨基酸序列但保留该蛋白质的功能或特性的多肽。本文中使用的术语“保守替换”意指将一个氨基酸用具有类似结构和/或化学性质的另一氨基酸替换。保守替换可对所得蛋白质或多肽的活性具有极小影响或没有影响。另外，变体包括其中一个或更多个部分例如n端前导序列或跨膜结构域已被去除的那些。此外，变体包括其中一部分已从成熟蛋白质的n和/或c端去除的那些。变体的能力与突变之前的多肽的能力相比可提高、不变或降低。在本公开内容中，术语“变体”可与术语例如突变体、修饰、变体多肽、经修饰的蛋白质、突变等互换使用。

20、根据本公开内容的一个实施方案，乙酰鸟氨酸氨基转移酶变体可具有seq id no:4的氨基酸序列。

21、本文中使用的术语“载体”意指能够在合适的宿主细胞中表达目的蛋白质的表达载体，并且是指包含与转基因可操作地连接以使得转基因得以表达的必需调节元件的基因构建体。本文中使用的术语“可操作地连接”意指待表达的基因以允许该基因表达的方式与其调节序列功能性地连接。“调节元件”包括用于影响转录的启动子、用于调节转录的任选操纵子序列、编码合适的mrna核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译的终止的序列。载体的实例包括但不限于质粒载体、黏粒载体、噬菌体载体、病毒载体等。可使用的噬菌体载体或黏粒载体的实例包括pwe15、m13、λembl3、λembl4、λfixii、λdashii、λzapii、λgt10、λgt11、charon4a和charon21a，并且可使用的质粒载体的实例包括pdz载体，以及基于pbr、基于puc、基于pbluescriptll、基于pgem、基于ptz、基于pcl和基于pet的载体。可使用的载体没有特别的限制，并且可使用任何已知的表达载体而没有限制。

22、在本公开内容中使用的“重组载体”被转化到合适的宿主细胞中之后，其可任选地独立于宿主基因组进行复制和发挥功能，或者在一些情况下可整合至基因组本身中。在这种情况下，“合适的宿主细胞”是其中载体可复制的宿主细胞，并且可包含复制起点，其是复制开始的特定核苷酸序列。

23、可使用根据宿主细胞选择的合适的载体引入技术进行转化，并且可在宿主细胞中表达目的基因。例如，载体引入可通过电穿孔、热激、磷酸钙(capo4)沉淀、氯化钙(cacl2)沉淀、显微注射、聚乙二醇(polyethylene glycol，peg)法、deae-葡聚糖法、阳离子脂质体法、乙酸锂-dmso法或其组合来进行。转化的基因可包括任何基因，无论该基因是插入至宿主细胞的染色体中还是位于染色体外，只要该基因可在宿主细胞中表达即可。

24、宿主细胞包括在体内或体外用本公开内容的重组载体或多核苷酸转染、转化或感染的细胞。包含本公开内容的重组载体的宿主细胞是重组宿主细胞、重组细胞或重组微生物。

25、另外，根据本公开内容的重组载体可包含选择标志物。选择标志物用于选择用载体转化的转化体(宿主细胞)。由于只有表达选择标志物的细胞才可在用选择标志物处理的培养基中存活，所以可选择经转化的细胞。选择标志物的代表性实例包括但不限于卡那霉素、链霉素、氯霉素等。

26、插入至根据本公开内容的用于转化的重组载体中的基因可通过同源重组交叉整合至宿主细胞(例如棒状杆菌属微生物)中。

27、根据本公开内容的一个实施方案，宿主细胞可以是棒状杆菌属菌株，例如谷氨酸棒状杆菌菌株。

28、本公开内容的另一个方面提供了用于产生l-精氨酸或l-瓜氨酸的方法，其包括以下步骤：在培养基中培养谷氨酸棒状杆菌突变体菌株；以及从所培养的突变体菌株中或从培养所述突变体菌株的培养基中回收l-精氨酸或l-瓜氨酸。

29、可使用本领域已知的合适培养基和培养条件进行培养，并且本领域任何技术人员可容易地调整和使用培养基和培养条件。特别地，培养基可以是液体培养基，但不限于此。培养方法的一些实例包括但不限于分批培养、连续培养、补料分批培养或其组合。

30、根据本公开内容的一个实施方案，培养基应当以适当的方式满足特定菌株的需求，并且可由本领域技术人员进行适当的修改。针对用于棒状杆菌属微生物或菌株的培养基，可参考已知文献(但不限于此)(manual of methods for general bacteriology,american society for bacteriology,washington d.c.,usa,1981)。

31、根据本公开内容的一个实施方案，培养基可包含多种碳源、氮源和微量元素组分。可使用的碳源的一些实例包括：糖类和碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；油和脂肪，例如大豆油、葵花籽油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸，例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇，例如甘油和乙醇；以及有机酸，例如乙酸。这些物质可单独使用或作为混合物使用，但不限于此。可使用的氮源的一些实例包括蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉、尿素，或者无机化合物例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源也可单独使用或作为混合物使用，但不限于此。可使用的磷源的一些实例包括但不限于磷酸二氢钾或磷酸氢二钾、或者相应的含钠盐。另外，培养基可包含但不限于生长所需的金属盐，例如硫酸镁或硫酸铁。另外，培养基可包含必需的生长物质，例如氨基酸和维生素。此外，可在培养基中使用合适的前体。可在培养期间将培养基或单独的组分通过合适的方法分批或以连续方式添加至培养基中，但不限于此。

32、根据本公开内容的一个实施方案，培养基的ph可通过在培养期间以适当方式向微生物培养基中添加化合物例如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸来调节。另外，在培养期间，可使用消泡剂例如脂肪酸聚乙二醇酯来抑制发泡。另外，为了将培养基保持在有氧条件下，可将氧气或含氧气体(例如，空气)注射至培养基中。培养基的温度通常可以是20℃至45℃，例如25℃至40℃。可继续培养直至产生所期望量的可用物质。例如，培养时间可以是10小时至160小时。

33、根据本公开内容的一个实施方案，在从所培养的突变体菌株中和从培养所述突变体菌株的培养基中回收l-精氨酸或l-瓜氨酸的步骤中，所产生的l-精氨酸或l-瓜氨酸可根据培养方法使用本领域已知的合适方法来从培养基中收集或回收。可使用的用于回收l-精氨酸或l-瓜氨酸的方法的实例包括但不限于离心、过滤、萃取、喷洒、干燥、蒸发、沉淀、结晶、电泳、分级溶解(例如，硫酸铵沉淀)、色谱(例如离子交换、亲和力、疏水性和尺寸排阻)等。

34、根据本公开内容的一个实施方案，回收l-精氨酸或l-瓜氨酸的步骤可通过将培养基在低速下离心以去除生物质并通过离子交换色谱分离所获得的上清液来进行。

35、根据本公开内容的一个实施方案，回收l-精氨酸或l-瓜氨酸的步骤可包括纯化l-精氨酸或l-瓜氨酸的过程。

36、根据本公开内容的棒状杆菌属突变体菌株具有参与l-精氨酸生物合成途径的乙酰鸟氨酸氨基转移酶的增强的活性，并且因此能够以与亲本菌株相比提高的产率来产生l-精氨酸或l-瓜氨酸。