检测牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒和牛细小病毒的多重PCR试剂盒及应用

本发明涉及一种用于牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒、牛细小病毒多重pcr检测试剂盒。属于生物检测。

背景技术：

1、牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrheavirus，bvdv)、牛冠状病毒(bovinecoronavirus，bcov)、牛轮状病毒(bovine rotavirus，brv)和牛细小病毒(bovineparvovirus，bpv)感染均能够引起牛的消化道疾病，临床以腹泻为主要特征，且存在混合感染，临床表现难以区分，增加了疫病诊断难度。同时可继发细菌感染，进而加重病程，给养牛业造成重大的经济损失。

2、目前已有bcov和brv的双重rt-pcr检测方法以及bvdv、brv和bcov的多重rt-pcr检测方法。但仍然缺乏能够同时鉴别bvdv、bcov、brv和bpv的快速检测方法。因此，开发快速准确鉴别bvdv、bcov、brv和bpv的检测方法及检测试剂盒具有重要意义和应用价值。

3、本发明基于pcr技术具有灵敏度高、特异性强、检测快速、检测通量高等优点，建立快速鉴别检测bvdv、bcov、brv和bpv的多重pcr方法，并组装检测试剂盒，可通过一次pcr反应，实现对上述4种病毒的快速鉴别检测，极大地提高检测效率，同时降低检测成本。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种能够同时检测牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒和牛细小病毒的多重pcr试剂盒及其应用。

2、为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

3、本发明基于多重pcr检测方法的优势，选择bvdv 5'-utr基因、bcovnsp10基因、brvvp6基因和bpvvp2基因为靶基因，以期建立检测上述4种病毒的多重pcr方法，为快速鉴别bvdv、bcv、brv和bpv感染以及流行病学调查提供必要的技术支持。本发明根据上述4种致牛腹泻病毒的特点，从分子角度设计高特异性引物，建立多重pcr检测方法。主要步骤如下：

4、(1)特异性引物设计与合成

5、(2)重组质粒的构建

6、(3)pcr反应条件优化

7、(4)多重pcr方法敏感性验证

8、(5)多重pcr方法的特异性验证

9、(6)临床样本检测

10、实验结果证明，本发明具有良好的特异性与灵敏性，能够为bvdv、bcov、brv和bpv致牛病毒性腹泻病原的特异性检测提供技术手段。

11、具体的，本发明的一种用于检测牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒和牛细小病毒的多重pcr试剂盒，所述的试剂盒中含有分别用于检测牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒和牛细小病毒的引物对；

12、其中，用于检测牛病毒性腹泻病毒的引物对由seq id no.1所示的上游引物以及seq id no.2所示的下游引物组成；

13、其中，用于检测牛冠状病毒的引物对由seq id no.3所示的上游引物以及seq idno.4所示的下游引物组成；

14、其中，用于检测牛轮状病毒的引物对由seq id no.5所示的上游引物以及seq idno.6所示的下游引物组成；

15、其中，用于检测牛细小病毒的引物对由seq id no.7所示的上游引物以及seq idno.8所示的下游引物组成。

16、其中，优选的，所述的试剂盒中还含有rtaq酶、10×pcr缓冲液以及dntp混合物。

17、其中，优选的，所述的试剂盒用于检测牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒和牛细小病毒时，其多重pcr反应体系包括：rtaq酶0.6μl、10×pcr缓冲液2.5μl、dntp混合物3μl、分别用于检测牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒和牛细小病毒的上下游引物各1.4μl、模板1μl，ddh2o补足25μl。

18、其中，优选的，所述的试剂盒用于检测牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒和牛细小病毒时，其多重pcr反应条件为：94℃5min；94℃30s，55.0℃～55.7℃30s，72℃45s；72℃8min，35个循环。

19、进一步的，本发明还提出了所述的多重pcr试剂盒在制备同时检测牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒和牛细小病毒试剂中的应用。

20、相较于现有技术，本发明的有益效果是：

21、目前尚缺乏同时能够快速鉴别检测bvdv、bcov、brv和bpv的方法，虽然利用现有的单重检测方法可以完成本发明的目的，但是费时费力。

22、本发明基于多重pcr方法的优势，以bvdv 5'-utr、bcov nsp10、brv vp6和bpv vp2基因为靶基因，建立了可同时鉴别检测bvdv、bcov、brv和bpv的四重pcr方法，通过一次pcr反应，实现对上述4种病毒bvdv、bcov、brv和bpv的快速鉴别检测，极大地提高了检测效率，同时降低了检测成本。

技术特征：

1.一种用于检测牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrheavirus，bvdv)、牛冠状病毒(bovine coronavirus，bcov)、牛轮状病毒(bovine rotavirus，brv)和牛细小病毒(bovine parvovirus，bpv)的多重pcr试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有分别用于检测牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒和牛细小病毒的引物对；

2.如权利要求1所述的多重pcr试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还含有rtaq酶、10×pcr缓冲液以及dntp混合物。

3.如权利要求1所述的多重pcr试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒用于检测牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒和牛细小病毒时，其多重pcr反应体系包括：rtaq酶0.6μl、10×pcr缓冲液2.5μl、dntp混合物3μl、分别用于检测牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒和牛细小病毒的上下游引物各1.4μl、模板1μl，ddh2o补足25μl。

4.如权利要求3所述的多重pcr试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒用于检测牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒和牛细小病毒时，其多重pcr反应条件为：94℃5min；94℃30s，55.0℃～55.7℃30s，72℃45s；72℃8min，35个循环。

5.权利要求1-4任一项所述的多重pcr试剂盒在制备同时检测牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒和牛细小病毒试剂中的应用。

技术总结
本发明公开了一种检测牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒和牛细小病毒的多重PCR试剂盒及应用。所述的试剂盒中含有分别用于检测牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒和牛细小病毒的引物对，其序列分别如SEQ ID NO.1‑8所示。本发明基于多重PCR方法的优势，以BVDV5'‑UTR、BCoVNsp10、BRVVP6和BPVVP2基因为靶基因，建立了可同时鉴别检测BVDV、BCoV、BRV和BPV的四重PCR方法，通过一次PCR反应，实现对上述4种病毒BVDV、BCoV、BRV和BPV的快速鉴别检测，极大地提高了检测效率，同时降低了检测成本。

技术研发人员：徐义刚,钟林翰,李园,王美,姜胜,宋厚辉
受保护的技术使用者：浙江农林大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16