人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化培养基、配制方法及其应用与流程

1.本发明涉及干细胞技术领域，特别是一种人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化培养基、配制方法及其应用。


背景技术：

2.关节软骨损伤是临床常见的病症，它不仅在老年人群中高发，近年来也有在年轻群体里高发的趋势。关节软骨内缺乏血管的直接营养、缺少高质量有效迁移能力的软骨细胞和干细胞，这导致关节软骨自我修复能力收到限制。现有多通过手术方法治疗关节软骨损伤，包括软骨下钻孔、微骨折、磨削成形术、关节置换术和自体软骨细胞移植等方法，但这些方法因受技术难度、组织整合差和发育形成纤维软骨的影响存在局限性等缺点，已不能满足临床上对于软骨组织修复治疗的需求，寻求新的治疗手段是目前修复软骨组织损伤亟待解决的问题。
3.近年来软骨损伤修复的研究逐渐转向细胞移植软骨组织工程方向，其中软骨细胞和间充质干细胞在软骨组织工程研究领域越来越受到关注。
4.人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hucmscs)是间充质干细胞的一种，它具有多向分化潜能，可分化为成软骨细胞。人脐带间充质干细胞容易获取，相对较易受供体年龄因素影响的骨髓间充质干细胞和易受到医学伦理限制的胎儿来源的间充质干细胞而言，此类干细胞具有增殖效率高、供体广泛、病毒感染率低且免疫原性较低等特点，可能成为临床上用于软骨组织工程研究更好的选择。
5.人脐带间充质干细胞具有成软骨分化潜能，在体外诱导培养人脐带间充质干细胞向成软骨细胞分化的过程中，通过添加外源性生长因子，可增强人脐带间充质干细胞成软骨分化的能力。其中转化生长因子β(transforming growth factor-β，tgf-β)、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，bmp)、胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1，igf-1)是调节干细胞成软骨分化的几个关键性因子，这些关键因子通过调控几个促进软骨细胞形成的关键基因(col1、aggrecan和sox9)的表达，可诱导干细胞向软骨细胞定向分化。
6.通过在培养人脐带间充质干细胞的完全培养基中添加外源性诱导因子可以提高人脐带间充质干细胞成软骨分化的能力。但现有用于诱导人脐带间充质干细胞定向分化为软骨细胞所用诱导培养基，存在定向诱导后软骨细胞数量较少，软骨陷窝分散不均匀且分化效果较差的问题，无法对人脐带间充质干细胞进行有效诱导得到所需软骨细胞，阻碍了细胞移植软骨组织工程领域的各项研究开展。


技术实现要素：

7.本发明提供了一种人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化培养基、配制方法及其应用。
8.本发明第一方面提供了一种人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化培养基，所述培养基包括：基础培养基、诱导因子和添加因子；
9.其中基础培养基的组成包括：青霉素、链霉素、谷氨酰胺、fbs和高糖dmem培养基；
10.诱导因子包括：地塞米松、tgf-β1、维生素c磷酸盐和its+1；
11.添加因子包括：泽泻醇b；泽泻醇b的加入量(在人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化培养基中的含量)为50μmol/l以上。
12.一些具体实施方案中，所用基础培养基、诱导因子可按经典成软骨诱导分化完全培养基中各成分的比例添加配制。
13.一些具体实施方案中，泽泻醇b按本发明的成软骨诱导分化完全培养基的配制要求选取上限值，例如200μmol/l。
14.一些具体实施方案中，本发明中所用its+1(its+1liquid media supplement)是按照10mg/ml重组人胰岛素，0.55mg/ml人转铁蛋白，0.5μg/ml亚硒酸钠，50mg/ml bsa，470μg/ml亚油酸，5ml不含酚红的ebss的比例加入相应组分配制而成的混合液。
15.一些具体实施方案中，本发明的培养基主要由上述组分组成(除特别注明外，本发明所述培养基或混合液的余量组分为水)。
16.为证明本发明提供培养基适用于该干细胞的定向分化诱导，配制的培养基根据实验需要设置10个不同分组，并记为a-f5，每一个组别，用相对应的培养基对人脐带间充质干细胞进行培养，培养到21-28天时琼脂包埋切片并用阿利新蓝染色液对其进行染色，并在倒置显微镜或正置显微镜下观察不同组合培养基对人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化的分化程度。
17.采用本发明提供的上述培养基，按现有技术中的常用诱导培养方法，进行软骨细胞分化诱导培养后，所得细胞通过阿利新蓝染色液染色后，在荧光倒置显微镜下观察软骨陷窝，结果发现，与普通培养基及其商业化培养基培养的成软骨细胞相比较，本发明提供的培养基组合物f3组培养的软骨细胞内的内酸性粘多糖被阿利新蓝染成蓝色，软骨陷窝间分散平滑，软骨细胞密度及数量远高于其他各类现有培养基及其余泽泻醇b浓度的培养基所得结果。说明本发明提供的培养基对人脐带间充质干细胞具有较好定向分化诱导作用，尤其适用于将人脐带间充质干细胞诱导分化培养成软骨细胞。
18.一些具体实施方案中，优选地，泽泻醇b的加入量为50μmol/l、80μmol/l、100μmol/l、150μmol/l或200μmol/l。按这些比例添加泽泻醇b均能取得上述培养分化效果。
19.一些具体实施方案中，优选地，泽泻醇b的加入量为100μmol/l。采用该比例添加泽泻醇b，所得软骨细胞数量最多，为经典培养基对照组的6倍。分化效果最优。
20.一些具体实施方案中，优选地，青霉素、链霉素、胎牛血清以及谷氨酰胺的用量分别为：
21.青霉素：100u/ml，链霉素：100μg/ml，fbs：总体积的5％，谷氨酰胺：2mm/l。
22.一些具体实施方案中，优选地，地塞米松、tgf-β1、维生素c磷酸盐和its+1用量分别为：地塞米松：10μg/ml，tgf-β1：10ng/ml，维生素c磷酸盐：50μg/ml，its+1：1％。
23.诱导因子添加到基础培养基中，配制成经典成软骨诱导分化培养基，该培养基除基础培养基外，还含有10μg/ml地塞米松、10ng/ml tgf-β1、50μg/ml维生素c磷酸盐和1％ its+1；按此比例混合上述物质，能有效协助泽泻醇b发挥对所述干细胞的定向分化作用。
24.一些具体实施方案中，优选地，its+1各组分用量为：重组人胰岛素：10mg/ml，人转铁蛋白：0.55mg/ml，亚硒酸钠：0.5μg/ml，bsa：50mg/ml，亚油酸：470μg/ml，不含酚红的ebss：5ml。
25.本发明的另一方面还提供了一种配制上述人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化培养基的方法，该方法包括：
26.1)向高糖dmem培养基中分别加入5％比例的fbs、100u/ml的青霉素和100μg/ml链霉素和2mm/l谷氨酰胺，混合搅拌均匀；
27.2)随后分别加入10μg/ml地塞米松、10ng/ml tgf-β1、50μg/ml维生素c磷酸盐和1％ its+1，混匀得到混合培养基；
28.3)在混合培养基中加入泽泻醇b并混匀，得到人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化培养基。
29.本发明的配制方法优选在无菌环境下进行操作。
30.优选地，人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化培养基中加入泽泻醇b，使其终浓度为50μmol/l、80μmol/l、100μmol/l、150μmol/l或200μmol/l；进一步优选地，泽泻醇b的浓度为100μmol/l。
31.采用上述方法配制所述培养基，配制方法简单，配制效率较高。
32.本发明的另一方面还提供了一种人脐带间充质干细胞体外诱导定向分化软骨细胞的方法，该方法包括：
33.将人脐带间充质干细胞接种于本发明所述的人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化培养基中并进行诱导培养，得到软骨细胞。
34.一些具体实施方案中，本发明的人脐带间充质干细胞体外诱导定向分化软骨细胞的方法还包括人脐带间充质干细胞的体外分离、培养和确认过程：
35.1)进行人脐带间充质干细胞的体外分离及培养：
36.具体地，取来自18-26周岁、健康、首次妊娠、夫妻两家均无遗传病史以及大病史、剖腹产的孕妇的脐带，无菌条件下分离脐带华通氏胶，用无血清无酚红间充质干细胞培养基培养扩增人脐带间充质干细胞，待细胞长出并增值一定数量后用重组胰酶消化细胞，并进行多次传代培养，直至传代培养到p10代；
37.2)采样流式细胞技术鉴定细胞表面抗原：
38.具体地，取任意传代培养的人脐带间充质干细胞，对其进行表面抗体标记，通过流式细胞技术确定标记抗体所占的比列，以此对人脐带间充质干细胞进行确认；更具体地，所述表面抗体标记位点为cd90、cd105、cd73、cd34、cd19、cd45、cd11b和hla-dr。
39.之后，将所确认的人脐带间充质干细胞接种于上述培养基中并进行诱导培养后，得到软骨细胞。
40.将得到的软骨细胞采用琼脂包埋、切片机切片、阿利新蓝染色后进行计数。
41.上述方法从新生儿脐带中分离培养得人脐带间充质干细胞，并通过流式细胞技术鉴定培养得到的间充质干细胞纯度，通过流式细胞技术鉴定后的细胞具有更高的纯度且对后续分化结果具有更高的可靠性及准确度。随后通过设置不同诱导组培养基培养人脐带间充质干细胞诱导其向软骨细胞进行分化，通过阿利新蓝染色液染色后在荧光倒置显微镜下观察软骨球细胞分化效果，该方法操作简单，能从直观上得到不同诱导组的诱导结果，并通
过对比得到最优的培养基组合方案。
42.本发明的另一方面还提供了一种使用上述培养基或按上述诱导定向分化方法诱导培养得到的软骨细胞。通过阿利新蓝染色液染色后，在倒置显微镜或正置显微镜下观察软骨陷窝，结果发现，与普通培养基及其商业化培养基培养的成软骨细胞相比较，所得软骨细胞内的内酸性粘多糖被阿利新蓝染成蓝色，软骨陷窝间分散平滑。本发明的具有该形态结构的软骨细胞能更好的形成软骨球，且软骨陷窝分散更加均匀。
43.本发明能产生的有益效果包括：
44.1)本发明所提供的人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化培养基、配制方法及其应用，通过在培养人脐带间充质干细胞的普通培养基中添加外源性生长因子和泽泻醇b，诱导人脐带间充质干细胞成软骨细胞定向分化。结果显示添加了泽泻醇b的经典成软骨诱导培养基与其他组合培养基相比诱导分化效果更好，这为培养人脐带间充质干细胞成软骨分化提供了更优的方案。
45.2)本发明所提供了人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化培养基、配制方法及其应用，采用所述培养基对人脐带间充质干细胞向软骨细胞分化进行诱导培养后，分化出的成软骨细胞更多，通过阿利新蓝染色后，软骨陷窝分散更加均匀且分化程度更好，细胞分化程度更高，分化为软骨细胞的时间更短，而且操作简单。
附图说明
46.图1为从人脐带中分离培养得到的间充质干细胞结果图。
47.图2为流式细胞技术鉴定的从脐带分离出的间充质干细胞表面标记物结果图。
48.图3为人脐带间充质干细胞诱导成软骨细胞分化培养终点的软骨球照片。
49.图4为人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化阿利新蓝染色结果。
具体实施方式
50.为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述。
51.以下实施例中所用物料如无特殊说明均为市售。
52.实施例1：人脐带间充质干细胞的分离及培养
53.本实施例提供一种人脐带间充质干细胞的分离及培养的方法，具体操作如下：
54.1)采集清理新鲜脐带：将采集的新鲜脐带置于145培养皿中，用pbs清洗除去脐带表面的血渍，将脐带放入含1％双抗(青霉素和链霉素)的pbs中浸泡10min，用镊子顺着脐带轻轻刮动除去脐带里面的血块；
55.2)分离获得华通氏胶：将上述清理后的脐带浸泡于pbs中，用剪刀剪成2cm左右的小段，顺着静脉一边将脐带剪开，用镊子剥离里面的静脉和动脉，随后将华通氏胶分离出来，置于一个新的含有少量pbs的培养皿中；
56.3)华通氏胶原代培养：将华通氏胶剪碎成长度为1mm大小的组织，用少量的间充质干细胞完全培养基重悬后平铺于t75培养瓶中，置于37℃、5％co2培养箱中培养；培养2天后添加5ml完全培养基，期间持续观察，待有细胞长出后继续添加5ml完全培养基，直至细胞足够传代；
57.4)收集清洗原代细胞：倒掉培养上清，用pbs清洗细胞表面1次，尽可能除去组织块，加入4ml重组胰酶置于37℃消化4min，然后加入5ml完全培养基终止消化，收集细胞，同时用pbs清洗1次继续收集细胞；
58.5)传代培养：将收集的细胞悬液过70μm细胞筛网，收集滤液，400
×
g/min、20℃离心5min，弃上清，将细胞用完全培养基重悬后取100μl用台盼蓝染色法进行计数，按8000个/cm2密度接种于t75培养瓶置于37℃、5％co2培养箱中培养，记为p1代，待细胞汇合度达到90％左右时用胰酶将细胞消化并进行传代培养，得到人脐带间充质干细胞。
59.从人脐带中分离培养得到的间充质干细胞结果如图1所示，其中，图片a为人脐带间充质干细胞传代培养至p2代的结果图，图片b为人脐带间充质干细胞传代培养至p4代的结果图，图片c为人脐带间充质干细胞传代培养至p5代的结果图，图片d为人脐带间充质干细胞传代培养至p10代的结果图。由图1可知，按上述方法成功从人脐带中分离培养得到间充质干细胞，并进行多次传代培养得到不同代次的细胞，且该细胞在培养过程中生长状况良好，成规则的梭形结构。
60.实施例2：流式细胞技术鉴定从人脐带中分离得到的间充质干细胞表面抗原
61.本实施例提供采用流式细胞技术鉴定从人脐带中分离得到的间充质干细胞表面抗原的方法，具体操作如下：
62.1)准备细胞悬液：选取实施例1中的p5代细胞，用胰酶进行消化后制成细胞悬液，取100μl用台盼蓝染色法进行细胞计数。用pbs清洗细胞悬液两次，1500rpm离心5分钟，弃上清。用pbs重悬细胞沉淀，调整细胞浓度至1
×
107个/ml，并用200目70μm的细胞筛过滤除去未消化充分的细胞团块。
63.2)对细胞进行表面抗体标记：取8支2ml离心管，分别标记1-8号，往每支离心管中加入100μl过滤好的细胞悬液。并按照表1所示加入人脐带间充质干细胞流式检测试剂盒中(bd)的相应组分进行抗体标记。
64.表1.人脐带间充质干细胞表面抗体标记
[0065][0066]
3)抗体孵育：将各管组分混合均匀后，避光2-8℃孵育30min。孵育结束用pbs清洗两次，1500rpm离心5分钟，弃上清。再用500μl pbs重悬细胞沉淀，随后用bd accuri c6流式细胞仪进行上样检测。
[0067]
4)设置流式细胞仪条件：上样前打开bd accuri c6 plus软件，并温和地重悬流式管中的细胞，将样品管放在上样针处。根据细胞光散射特性设门，门内收集至少20000个细胞。
[0068]
其中各样品管的作用为：1-4号单染管作为调节流式细胞仪各通道阈值和补偿及阴阳性界定参考；5号为空白对照调节细胞、仪器背景；6为阳性阴性同型抗体对照，确定荧光抗体非特异性信号及阴阳性界定参考；7号和8号为供试品检测管。
[0069]
5)结果分析：样品上样结束后，对上样结果进行分析，根据所汇门创建散点图及直方图，计算阳性细胞所占百分数及阴性细胞所占百分数。
[0070]
表面抗体(cd90、cd105、cd73、cd34、cd19、cd45、cd11b和hla-dr)标记的结果如图2所示。图2为流式细胞技术鉴定从脐带分离出的间充质干细胞表面标记物结果图；其中图片a为表面抗体cd90的标记物结果图；图片b为表面抗体cd34、cd19、cd45、cd11b和hla-dr的标记物结果图；图片c为表面抗体cd105的标记物结果图；图片d为表面抗体cd73的标记物结果图。从图2中可知，该细胞中含有间充质干细胞的特异性抗原标记物cd90、cd105和cd73，且不含有cd34、cd19、cd45、cd11b和hla-dr等标记物，可以确认其是间充质干细胞。
[0071]
实施例3：配制不同组分的成软骨细胞诱导分化培养基
[0072]
本实施例提供不同组分的诱导分化培养基。
[0073]
根据实验需要，设置了a-f5共10组含有不同组分的培养基。其中a组为阴性对照组，b组为经典成软骨诱导分化完全培养基组，c-e组为商业化成软骨诱导培养基培养组，f1-f5组为本发明提供的培养基作为实验组(泽泻醇b诱导组)。f1-f5组成分除泽泻醇b含量不同外，其余成分含量均相同，f1-f5各组泽泻醇b的含量分别为：f1组所含泽泻醇b为50μmol/l、f2组为80μmol/l、f3组为100μmol/l、f4组为150μmol/l、f5组为200μmol/l。具体各组培养基的成分及配制方法如下：
[0074]
(1)a组：为阴性对照组(基础培养基组)，其组分如表2所示：
[0075]
表2.基础培养基
[0076]
成分用量胎牛血清(fbs)5％(占总体积)青霉素100u/ml链霉素100μg/ml谷氨酰胺2mm/l高糖dmem培养基45ml
[0077]
具体操作步骤：
[0078]
1)配制双抗备用：无菌环境下进行操作。将80万单位的青霉素粉末溶于2ml生理盐水中，并分装保存于-20℃备用。称取1g链霉素粉末溶于4ml生理盐水中，分装后保存于-20℃备用。
[0079]
2)配制基础培养基：吸取45ml高糖dmem培养基于50ml离心管中，随后按照表2所示加入相应比例的fbs、双抗和谷氨酰胺(本发明所述各组分的浓度为占总体积的浓度)，用移液枪吹打混匀后得到基础培养基。
[0080]
(2)b组：为经典成软骨诱导分化完全培养基组，其组分如表3所示：
[0081]
表3.经典成软骨诱导分化完全培养基
[0082]
成分用量胎牛血清(fbs)5％(占总体积)青霉素100u/ml
链霉素100μg/ml谷氨酰胺2mm/l高糖dmem培养基45ml地塞米松10μg/mltgf-β110ng/ml维生素c磷酸盐50μg/mlits+11％(占总体积)
[0083]
无菌环境下进行操作。首先按照表4所示配制its+1。
[0084]
表4.its+1组分表
[0085]
成分用量重组人胰岛素10mg/ml人转铁蛋白0.55mg/ml亚硒酸钠0.5μg/mlbsa50mg/ml亚油酸470μg/ml不含酚红的ebss5ml
[0086]
具体操作步骤：
[0087]
1)在无菌环境下进行操作，向5ml不含酚红的ebss中分别加入重组人胰岛素：10mg/ml，人转铁蛋白：0.55mg/ml，亚硒酸钠：0.5μg/ml，bsa：50mg/ml，亚油酸：470μg/ml。得到its+1备用。
[0088]
2)向高糖dmem培养基中分别加入5％体积比例的fbs、100u/ml的青霉素和100μg/ml链霉素和2mm/l谷氨酰胺，得到基础培养基备用。
[0089]
3)随后按表3向基础培养基中分别加入10μg/ml地塞米松、10ng/ml tgf-β1、50μg/ml维生素c磷酸盐和1％ its+1，混匀，配制经典成软骨细胞诱导培养基。
[0090]
(3)c-e组为商业化成软骨诱导培养基培养组。其中
[0091]
c组：为从promcell购买的试剂盒配制的成软骨诱导培养基组(所得结果如图4的图片c)；
[0092]
d组：为从sciencell购买的试剂盒配制的成软骨诱导培养基组(所得结果如图4的图片d)；
[0093]
e组：为从赛业生物购买的试剂盒配制的成软骨诱导培养基组(所得结果如图4的图片e)；
[0094]
c-e组分别按照对应试剂盒说明书操作方法，配制商业化成软骨细胞分化培养基。
[0095]
(4)f1组：为本发明提供的培养基作为实验组(泽泻醇b诱导组)。其组分如表5所示：
[0096]
表5.实验组培养基
[0097]
成分用量胎牛血清(fbs)5％(占总体积)青霉素100u/ml链霉素100μg/ml
谷氨酰胺2mm/l高糖dmem培养基45ml地塞米松10μg/mltgf-β110ng/ml维生素c磷酸盐50μg/mlits+11％(占总体积)泽泻醇b50μmol/l
[0098]
f2组：为本发明提供的培养基作为实验组(泽泻醇b诱导组)。其组分如表6所示：
[0099]
表6.实验组培养基
[0100]
成分用量胎牛血清(fbs)5％(占总体积)青霉素100u/ml链霉素100μg/ml谷氨酰胺2mm/l高糖dmem培养基45ml地塞米松10μg/mltgf-β110ng/ml维生素c磷酸盐50μg/mlits+11％(占总体积)泽泻醇b80μmol/l
[0101]
f3组：为本发明提供的培养基作为实验组(泽泻醇b诱导组)。其组分如表7所示：
[0102]
表7.实验组培养基
[0103]
成分用量胎牛血清(fbs)5％(占总体积)青霉素100u/ml链霉素100μg/ml谷氨酰胺2mm/l高糖dmem培养基45ml地塞米松10μg/mltgf-β110ng/ml维生素c磷酸盐50μg/mlits+11％(占总体积)泽泻醇b100μmol/l
[0104]
f4组：为本发明提供的培养基作为实验组(泽泻醇b诱导组)。其组分如表8所示：
[0105]
表8.实验组培养基
[0106]
成分用量胎牛血清(fbs)5％(占总体积)青霉素100u/ml
链霉素100μg/ml谷氨酰胺2mm/l高糖dmem培养基45ml地塞米松10μg/mltgf-β110ng/ml维生素c磷酸盐50μg/mlits+11％(占总体积)泽泻醇b150μmol/l
[0107]
f5组：为本发明提供的培养基作为实验组(泽泻醇b诱导组)。其组分如表9所示：
[0108]
表9.实验组培养基
[0109]
成分用量胎牛血清(fbs)5％(占总体积)青霉素100u/ml链霉素100μg/ml谷氨酰胺2mm/l高糖dmem培养基45ml地塞米松10μg/mltgf-β110ng/ml维生素c磷酸盐50μg/mlits+11％(占总体积)泽泻醇b200μmol/l
[0110]
f1-f5组为本实施例中实验组，其培养基配制方法为：先按照b组配制方法配制经典成软骨诱导分化完全培养基，最后再每组分别加入50μmol/l、80μmol/l、100μmol/l、150μmol/l、200μmol/l泽泻醇b，并用移液枪将组分混匀后备用。
[0111]
实施例4：不同培养基对人脐带间充质干细胞进行成软骨细胞诱导分化
[0112]
本实施例使用实施例3中配制的10组培养基对人脐带间充质干细胞进行成软骨细胞诱导分化。具体操作如下：
[0113]
(1)细胞传代并分组：在传代培养至p5代的人脐带间充质干细胞融合度达到80-90％时，用胰酶进行消化处理，用间充质干细胞培养基清洗两次，1500rpm离心5分钟，弃上清。再用间充质干细胞培养基将沉淀重悬，取100μl用台盼蓝染色法进行细胞计数。
[0114]
(2)细胞诱导培养：分别取实施例3中配制的a-f5共10组培养基于15ml离心管中，每个分组分别设置三个生物学重复。将(1)中处理好的人脐带间充质干细胞按照5
×
105cells/管的细胞密度接种在15ml离心管中，500g离心5min，吸去上清，往离心管中加入0.5ml各组对应培养基重悬细胞沉淀，再取500g离心5min，拧松离心管盖以便于气体交换，置于37℃，5％co2的培养箱中培养。随后每隔3天吸去各离心管内培养基，并换上各组相对应的新的培养基。诱导21-28天后，视细胞的形态变化及生长情况，拍照保存，各组照片如图3所示。。
[0115]
图3为人脐带间充质干细胞诱导成软骨细胞分化培养终点的软骨球照片；其中图片a为阴性对照组培养终点的软骨球照片；图片b为经典成软骨诱导培养基培养终点的软骨
球照片；图片c为从promcell购买的试剂盒配制的成软骨诱导培养基培养终点的软骨球照片；图片d为从sciencell购买的试剂盒配制的成软骨诱导培养基培养终点的软骨球照片；图片e为从赛业生物购买的试剂盒配制的成软骨诱导培养基培养的软骨球照片；图片f1-图片f5为本发明提供成软骨诱导培养基培养终点的软骨球照片。
[0116]
从图3可知，除阴性对照组细胞不呈球状外，其余各诱导组细胞均成球形状。
[0117]
实施例5：阿利新蓝染色鉴定
[0118]
本实施例提供成软骨诱导分化结束后，采用琼脂包埋切片后用阿利新蓝染色液进行染色的方法，以及10组培养基的诱导分化结果分析。
[0119]
阿利新蓝染色液进行染色步骤如下：
[0120]
(1)固定：成软骨诱导分化结束后，吸走15ml离心管中的培养基，每管加入0.5ml 4％中性甲醛溶液对细胞进行固定处理。
[0121]
(2)琼脂包埋并染色观察：固定后的软骨球进行琼脂包埋切片后用阿利新蓝溶液染色。
[0122]
实施例6
[0123]
染色后的软骨球做成特制的可计数玻片，在倒置显微镜或正置显微镜下观察成软骨染色效果并进行计数。进行2个区域左上、右上、左下、右下8大格软骨细胞的计数，并取平均数。
[0124]
图4为10组人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化后由阿利新蓝染色的结果。其中，图片a为普通培养基培养的人脐带间充质干细胞阴性对照组结果图；图片b为经典成软骨诱导培养基诱导组；图片c为从promcell购买的试剂盒配制的成软骨诱导培养基诱导组结果图，图片d为从sciencell购买的试剂盒配制的成软骨诱导培养基诱导组结果图，图片e为从赛业生物购买的试剂盒配制的成软骨诱导培养基诱导组结果图，图片f1-图片f5为本发明提供成软骨诱导培养基诱导组结果图。
[0125]
由图4可知，除普通培养基组(a组)培养的人脐带间充质干细胞不能分化出软骨细胞外，其余几组(b-f组)均能使人脐带间充质干细胞分化为软骨细胞，但是分化程度各不相同。
[0126]
其中，由图4的图片b可知，经典诱导培养基诱导组能使人脐带间充质干细胞向软骨细胞分化，但分化程度一般，分化后软骨细胞比例较低，大量干细胞均未发生定向分化；通过图4的图片f1-图片f5与该图所得结果的对比可知，本发明提供培养基在诱导该干细胞定向分化为软骨细胞方面具有明显优势，诱导效果较理想。f1组对比b组通过特制的载玻片进行相对计数后多了4倍。f2组为4.5倍。f3组为6倍，f4组为5.5倍，f5组为5.5倍。尤其为f3组在诱导该干细胞定向分化为软骨细胞方面效果最理想，为6倍。
[0127]
采用现有商业化培养基诱导程度相当参见图4的图片c-图片e，所用商用培养基的诱导效果优于经典培养基诱导组，但由图4可见，现有商用培养基的诱导结果依然不如本发明提供的培养基诱导结果。
[0128]
参见图4的图片f3，本发明提供培养基f3的实验组诱导效果最好，软骨细胞数量较多，软骨陷窝分散均匀且分化效果明显好于其他任何一组诱导的情况。
[0129]
由图4可知，与普通培养基及其商业化培养基培养的成软骨细胞相比较，本发明提供的培养基组合物培养的软骨细胞内的内酸性粘多糖被阿利新蓝染成蓝色，软骨陷窝间分
散平滑，软骨细胞密度及数量远高于其他各类现有培养基所得结果。说明本发明提供培养基对人脐带间充质干细胞具有较好定向分化诱导作用，尤其适用于将人脐带间充质干细胞诱导分化培养软骨细胞中。
[0130]
综上可知，添加了100umol/l泽泻醇b培养基培养的人脐带间充质干细胞比经典的商品化培养基向成软骨细胞分化的数量更多，是其6倍。
[0131]
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。