一种ADP-核糖基环化酶高效重组表达及其蛋白纯化的方法与流程

本发明属于生物，具体涉及一种adp-核糖基环化酶高效重组表达及其蛋白纯化的方法。

背景技术：

1、adp-核糖基环化酶(adp-ribosyl cyclase，以下简称adprc)是一种催化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，以下简称nad)环化为环腺苷二磷酸核糖(cyclic adp-ribose，以下简称cadpr)的酶(lee,h.c.,and aarhus,r.(1991)adp-ribosyl cyclase:an enzyme that cyclizes nad+into a calcium-mobilizingmetabolite.cell regulation.2,203–209)。cadpr是多种细胞、组织和器官内调节钙离子浓度的第二信使。外源性的刺激会引起cadpr合成量的增加，从而释放胞内储存的钙离子，钙离子浓度的升高会引起信号转导，继而产生一系列生理反应。外源性的各种刺激主要是通过上调cadpr合成酶的分泌量，使cadpr合成量增加(lee,h.c.(1994)cyclic adp-ribose:a new member of a super family of signalling cyclicnucleotides.cell.signalling 6,591–600)和(lee,h.c.(1996)modulator andmessenger functions of cyclic adp-ribose in calcium signalling.recentprogress hormone res.51,355–389)。

2、研究发现adprc能够催化nad与烷醇的转糖基化反应。利用这一特性，adprc近年来被应用在表征细胞内rna 5’端nad的修饰，故市场对adprc纯化蛋白酶的需求越来越多。

3、目前，商业化adprc酶是以海兔卵子为原料，获得可溶性提取物，通过spectra/gelcm柱分离纯化(美国sigma公司，cas号：135622-82-1；货号：a9106)。纯化的酶在sds-page上显示为约30千道尔顿(kd)的单条带。然而，受全球海兔数量、人工捕捉等因素制约，导致商业化adprc供应链不稳定。1997年，美国明尼苏达州大学的cyrus munshi和hon cheung lee采用毕赤酵母发酵诱导表达adprc酶，并通过阳离子交换层析方法纯化(cyrus munshi andhon cheung lee(1997)，high-level expression of recombinant aplysia adpribosylcyclase in pichia pastoris by fermentation.protein expression andpurification 11,104–110)。但其表达水平相对较低，每升酵母菌液蛋白产量约为180毫克；此外，采用阳离子交换层析的纯化方法收集到的每个洗脱收集液组分都含有rna酶(rnase)污染，导致无法开展rna相关实验。综上所述，开发一种既能满足工业需求量的高效重组表达adprc的方法又能够完全去除rnase的adprc蛋白纯化方法具有重要应用价值。

技术实现思路

1、由于adprc蛋白纯化相关的研究中还未发现有将纯化后的adprc用于rna相关实验的报道，故目前还未发现解决adprc纯化后rnase问题的方法。有文献(kannt,a.,sicka,k.,kroll,k.,kadereit,d.&h.selective inhibitors of cardiac adpr cyclaseas novel anti-arrhythmic compounds.naunyn.schmiedebergs.arch.pharmacol.385,717–727(2012))报道，使用镍柱纯化昆虫系统表达出的带有his标签的adprc蛋白，然后将纯化的蛋白用于小分子抑制剂的筛选，但未进行rnase测试。另外，在不同纯化体系不带标签的纯化方案中，在获得上清收集液后单独使用阳离子交换层析法或者与分子排阻色谱法组合以纯化蛋白，由于阳离子交换层析与分子排阻色谱组合足以获得纯度高达95％以上目的蛋白，且这种纯度足以满足非rna相关实验，所以这些纯化方案均未进行后续的rna测试。在本发明的实施例中发现，阳离子交换层析法与分子排阻色谱法组合并不能有效纯化adprc，而本发明提供的阳离子交换层析与疏水作用层析组合可以实现对adprc酶的有效纯化。

2、为了解决现有技术中的adprc基因在毕赤酵母中的表达水平相对较低，且adprc蛋白纯化的方法无法完全去除rnase的问题，本发明对来源于美国加利福尼亚州海兔(aplysia californica)的adprc基因(原始的基因序列如seq id no:1所示)进行密码子优化，获得改造的adprc基因序列如seq id no:2所示。经过序列优化后的基因在毕赤酵母中能够高表达，每升酵母菌液蛋白产量大于1.2克。采用该纯化方法获得的每个洗脱收集液只有单一目标蛋白峰，去除了rnase污染，且各个洗脱收集液都可以进行高效的adprc酶催化反应。

3、为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之一为：一种密码子优化的adp-核糖基环化酶基因，所述adp-核糖基环化酶基因的核苷酸序列如seq id no:2所示。

4、本发明提供的技术方案之二为：一种重组表达载体，所述重组表达载体含有如技术方案之一所述的核苷酸序列；

5、在本发明的具体技术方案中，所述重组表达载体的表达载体为ppic9k质粒。

6、本发明提供的技术方案之三为：一种重组基因工程菌，所述重组基因工程菌含有如技术方案之一所述的adp-核糖基环化酶基因，或如技术方案之二所述的重组表达载体；

7、在本发明的具体技术方案中，所述重组基因工程菌的宿主菌为毕赤酵母(pichiapastoris)，例如毕赤酵母gs115菌株。

8、本发明提供的技术方案之四为：一种培养如技术方案之三所述的重组基因工程菌获得酶蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：

9、(1)挑选重组基因工程菌于ypd培养基中，振荡培养过夜；

10、(2)将步骤(1)获得的过夜培养物离心去除上清，重悬于bmgy液体培养基中，振荡培养过夜；

11、(3)将步骤(2)获得的过夜培养物离心去除上清，重悬于bmmy液体培养基中，振荡培养3-4天，每天添加甲醇诱导；所述甲醇的添加量例如1％(v/v)；

12、(4)离心，获得酵母上清液；

13、优选地，步骤(1)-(3)中，所述振荡培养在28-30℃下进行，和/或，步骤(2)-(4)中，所述离心为4000转/分钟离心5-10分钟。

14、本发明提供的技术方案之五为：如技术方案之一所述的密码子优化的adp-核糖基环化酶基因或如技术方案之二所述的重组表达载体在使用真核表达系统制备adp-核糖基环化酶中的应用。

15、优选地，所述真核表达系统为毕赤酵母，例如毕赤酵母gs115菌株。

16、本发明提供的技术方案之六为：一种纯化adp-核糖基环化酶的方法，所述方法包括使用阳离子交换层析和疏水作用层析组合来纯化adp-核糖基环化酶；

17、在本发明的具体技术方案中，所述阳离子交换层析包括以下步骤：

18、(1)将用置换缓冲液置换如技术方案之四所述的方法获得的酵母上清液，进一步过滤；

19、(2)在阳离子交换柱中加入2-5个柱体积的平衡缓冲液；优选平衡3个柱体积；

20、(3)将过滤后的酵母上清液过柱；

21、(4)用洗脱缓冲液进行梯度洗脱目的蛋白，获得收集液；

22、其中，所述置换缓冲液、平衡缓冲液为20-100毫摩尔/升hepes或25-200毫摩尔/升pb；所述洗脱缓冲液为20-100毫摩尔/升hepes或25-200毫摩尔/升pb、0.5-2摩尔/升nacl；所述置换缓冲液、平衡缓冲液和洗脱缓冲液的ph值为6.0-7.5；

23、在本发明优选的技术方案中，所述阳离子交换柱为hiprep sp hp 16/10；所述置换缓冲液、平衡缓冲液为20-100毫摩尔/升hepes；所述洗脱缓冲液为20-100毫摩尔/升hepes和0.5-2摩尔/升nacl；所述置换缓冲液、平衡缓冲液和洗脱缓冲液的ph值为6.8-7.5；

24、在本发明的具体技术方案中，所述疏水作用层析包括以下步骤：

25、(1)用2-5个柱体积平衡缓冲液平衡疏水层析柱；优选平衡3个柱体积，例如平衡1小时，流速1毫升/分钟；

26、(2)将经过上述阳离子交换层析获得的收集液用平衡缓冲液置换，12,000g离心后用所述的平衡缓冲液稀释至40-60毫升，然后过滤、上柱；

27、(3)用洗脱缓冲液进行线性梯度洗脱并收集目的蛋白；所述洗脱缓冲液为0.05-0.2摩尔/升na2hpo4、0.1-0.5摩尔/升na2hpo4、1-4摩尔/升na2so4或1-4摩尔/升nacl溶液；

28、其中，所述平衡缓冲液为1.2-1.7摩尔/升(nh4)2so4、1-4摩尔/升na2so4和1-4摩尔/升nacl溶液中的一种，以及0.1-0.5摩尔/升na2hpo4；所述平衡缓冲液和洗脱缓冲液的ph值为6.0-7.5；

29、在本发明优选的技术方案中，所述疏水层析柱为hiprep phenyl ff 16/10；所述的置换使用超滤管或透析袋；所述平衡缓冲液为1.2-1.7摩尔/升(nh4)2so4；所述洗脱缓冲液为0.1-0.5摩尔/升na2hpo4；所述平衡缓冲液和洗脱缓冲液的ph值为7.0-7.5

30、本发明的积极进步效果在于：

31、1.经过序列优化后的adprc基因在毕赤酵母中能够高表达，每升酵母菌液蛋白产量大于1.2克；

32、2.提供了一种能满足工业需求量的高效重组表达adprc的方法；

33、3.本发明采用的阳离子交换层析与疏水作用层析组合可以实现对adprc酶的有效纯化；采用该纯化方法获得的每个洗脱收集液只有单一目标蛋白峰，去除了rnase污染，且各个洗脱收集液都可以进行高效的adprc酶催化反应。