一种靶向沉默LRP1基因表达的shRNA序列、其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物医药，尤其涉及一种靶向沉默lrp1基因表达的shrna序列、其制备方法和应用。

背景技术：

1、目前，胃癌仍是我国最主要的癌症病种之一。根据全球最新癌症负担数据(globocan 2020)，胃癌发病率居恶性肿瘤第五位，死亡率居第四位。近五年全球胃癌平均年发病例数为180.6万例，我国为68.9万例(38.2％)，疾病负担严重，是癌症防治的重点。

2、目前有关数据表明，胃癌早期患者通过系统的治疗，康复率很高，而胃癌中晚期患者即便经过系统的治疗，死亡率也依然很高。近年来有学者通过相关研究发现，对胃癌患者进行胃镜活检检查与病理结合诊断，能够快速且准确的帮助患者提高临床诊断率，并快速的确定治疗方案进行治疗，利于患者的身体快速恢复。由于胃癌有广泛的侵入性，能较早扩散到转移部位。目前应用于临床治疗的生物抑制剂较少，且诊断特异性并不理想。因此，新的靶向标志物的发现与应用对于胃癌诊断尤为重要。

3、低密度脂蛋白受体相关蛋白-1(lrp1)作为一种内吞和细胞信号转导的受体蛋白，可与100多种不同的配体结合，通过与不同的细胞信号适配器和支架蛋白结合激活细胞信号转导。研究证实lrp1在不同肿瘤的生长和进展的过程中起调控作用，如steffene.storck等人研究发现，lrp1通过促进血脑屏障(bbb)毛细血管中淀粉样蛋白-β(aβ)的积累，驱动阿尔茨海默病(ad)的病理进程；camille boulagnon-rombi等人通过分析lrp1突变、mirna表达和甲基化在lrp1表达谱中的作用，确定lrp1表达与结肠癌的临床特征和转归相关。然而lrp1在胃癌中的研究甚少，因此探究其发挥的作用对胃癌的早期诊断和治疗具有重要意义。

4、rna干扰(rna interference，rnai)是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象，是一种依赖于双链rna特异性短序列实现转录后的基因沉默的技术。它是指当细胞中导入与内源性mrna编码区同源的双链rna(double stranded rna，dsrna)时，该mrna发生降解而导致基因表达沉默的现象。外源dsrna进入细胞后产生的小分子干扰rna(smallinterfering rna，sirna)的反义链和多种核酸酶形成了沉默复合物(rna-inducedsilencing complex，risc)。risc具有结合和切割mrna的作用而介导rna干扰的过程。目前实验室常用的rnai技术主要有sirna寡核苷酸载体与shrna慢病毒质粒表达载体。短发夹核糖核酸(shrna)可以通过病毒介导的转染保持稳定，能够减少脱靶效应。rnai具有特异性和高效性。这种技术已经成为研究基因功能的重要工具，并将在病毒病、遗传性疾病和肿瘤病的治疗方面发挥重要作用。

5、shrna首先被插入到慢病毒载体上形成重组慢病毒质粒，慢病毒质粒与其他辅助质粒借助于293t细胞形成慢病毒，最终用慢病毒转染细胞发挥shrna的沉默作用。在内切核酸酶的作用下，shrna被裂解成核苷酸链，由正义链和反义链组成。反义链与特定的酶结合形成由rna诱导的沉默复合物risc(risc复合物中含sirna、核酸外切酶、核酸内切酶以及解旋酶等元件)，核苷酸双链会被活化后的risc解聚成为两条单链，随后反义链识别并结合与其同源的靶mrna，在反义链的引导下活化型risc会切割靶mrna的特定位置，同时切割的mrna会被risc复合物中的酶特异性降解，从而阻断mrna的遗传信息传递。

6、针对癌症细胞相关基因设计的靶向药物已逐渐应用于临床。但目前还未有利用shrna技术特异性针对胃癌细胞lrp1基因设计的shrna，鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明提供了一种靶向沉默lrp1基因表达的shrna序列、其制备方法和应用。

2、本发明提供了一种用于靶向性沉默lrp1基因表达的shrna序列，shrna序列包括shlrp1-1序列和/或shlrp1-2序列，shlrp1-1序列的靶位点核苷酸序列如seq id no.1所示，shlrp1-2序列的靶位点核苷酸序列如seq id no.2所示。

3、可选的，制备shlrp1-1序列的正义链序列如seq id no.3所示，反义链序列如seqid no.4所示。

4、可选的，制备shlrp1-2序列的正义链序列如seq id no.5所示，反义链序列如seqid no.6所示。

5、本发明提供了一种包含上述shrna序列的慢病毒表达载体。

6、可选的，慢病毒表达载体由shlrp1-1序列和/或shlrp1-2序列克隆到慢病毒表达载体plko.1中得到。

7、本发明提供了上述慢病毒表达载体的构建方法，制备包括如下步骤：

8、s1、采用引物退火合成shlrp1-1序列和/或shlrp1-2序列；

9、s2、将合成的shlrp1-1和/或shlrp1-2序列克隆到慢病毒表达载体中。

10、本发明提供了上述shrna序列在制备抑制lrp1基因表达的药物方面的应用。

11、本发明提供了上述shrna序列在制备用于治疗/预防胃癌相关的药物中的应用。

12、本发明提供了一种用于治疗胃癌的药物，包含上述靶向沉默lrp1基因表达的shrna序列。

13、本发明提供了一种被靶向沉默的lrp1基因序列，其靶点序列如seq idno.1或seqid no.2所示。

14、本发明实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：

15、本发明基于lrp1基因的mrna序列设计并合成shrna分子，并构建shrna的寡核苷酸序列，这两对shrna序列通过慢病毒载体包装成慢病毒后感染人胃癌细胞，能够与lrp1基因的mrna结合，高效地干扰其转录和翻译，降低lrp1基因在胃癌细胞中的表达，抑制胃癌细胞的增殖。本发明设计的shrna序列限制抑制胃癌细胞ags的生长速率，对胃癌的治疗具有十分重要的意义。为以lrp1抑制剂为核心的胃癌治疗新策略提供理论基础，有望应用于制备高效、特异性强、副作用小的抗癌基因药物，尤其针对胃癌基因药物的研发，具有巨大的社会和经济效益。

技术特征：

1.一种用于靶向性沉默lrp1基因表达的shrna序列，其特征在于，所述shrna序列包括shlrp1-1序列和/或shlrp1-2序列，

2.根据权利要求1所述的shrna序列，其特征在于，制备所述shlrp1-1序列的正义链序列如seq id no.3所示，反义链序列如seq id no.4所示。

3.根据权利要求1所述的shrna序列，其特征在于，制备所述shlrp1-2序列的正义链序列如seq id no.5所示，反义链序列如seq id no.6所示。

4.一种包含如权利要求1～3任一项所述shrna序列的慢病毒表达载体。

5.根据权利要求4所述的慢病毒表达载体，其特征在于，所述慢病毒表达载体由shlrp1-1序列和/或shlrp1-2序列克隆到慢病毒表达载体中得到。

6.一种如权利要求4所述的慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于，制备包括如下步骤：

7.根据权利要求1～3任一项所述的shrna序列在制备抑制lrp1基因表达的药物方面的应用。

8.根据权利要求1～3任一项所述的shrna序列在制备用于治疗/预防胃癌相关的药物中的应用。

9.一种用于治疗胃癌的药物，其特征在于，包含如权利要求1～3任一项所述的靶向沉默lrp1基因表达的shrna序列。

10.一种被靶向沉默的lrp1基因序列，其特征在于，其靶点序列如seq id no.1或seqid no.2所示。

技术总结
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种靶向沉默LRP1基因表达的shRNA序列、其制备方法和应用。shRNA序列包括shLRP1‑1序列和/或shLRP1‑2序列，shLRP1‑1序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，shLRP1‑2序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还涉及用于表达上述shRNA序列慢病毒表达载体。本发明基于LRP1基因的mRNA序列设计并合成shRNA分子，可通过慢病毒载体包装成慢病毒后感染人胃癌细胞，与LRP1基因的mRNA结合，高效地干扰其转录和翻译，降低LRP1基因在胃癌细胞中的表达，抑制胃癌细胞的增殖。

技术研发人员：王明义,国东,丛海燕,葛丽娜,宋宇,刘鹏,谢龙,曲业敏,迟翔宇
受保护的技术使用者：威海市立医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11