猪1号染色体上与猪肋骨数性状相关的SNP标记引物对及其应用

猪1号染色体上与猪肋骨数性状相关的snp标记引物对及其应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种与猪肋骨数性状相关的snp标记引物对及其应用。


背景技术：

2.猪肉在中国人的肉类消费结构中占比在60％左右，随着人口的不断增长和生活水平的逐步提升，人们对于猪肉的需求也日益增加，提升猪肉产量是育种过程中的重要目标之一，提升优质猪肉产量更是重要的方向。肋骨的数量会影响胴体长度和肉产量，肋排肉更是最受消费者欢迎的优质猪肉部位。肋骨数是衡量猪胴体产肉率的重要指标，肋骨与胸椎相连，胸椎的数目决定了肋骨的数目，1根胸椎对应2根肋骨。随着肋骨数的增加，猪的体长或胴体长也在相应的增长，每增加一根肋骨可使成年猪体长增加约60mm，猪肉产量也因此相应的增加，选育肋骨数性状具有较大的经济价值。但是肋骨数性状主要是通过屠宰后测定，常规选育难度大。与传统育种相比，利用与性状相关的标记进行分子选择可以有效加快育种进程。研究猪肋骨数的遗传分子机制，鉴别影响猪肋骨数的有关分子标记应用于育种中，对选育多肋骨数和高产肉率的群体或新品系具有重要的经济效益。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于针对传统猪肋骨数测定难度大、选育耗时费力，选育效果慢的问题，提供与猪肋骨数相关的snp标记开发而成的选育分子标记。
4.本发明的另一个目的在于提供用于检测上述snp标记的引物对和检测方法。
5.本发明还有一个目的在于提供上述snp标记、分子标记、引物的用途。
6.本发明的目的可通过以下技术方案实现：
7.猪1号染色体上与猪肋骨数性状相关的分子标记，所述的分子标记序列如seq id no：1所示，其中含有一个与猪肋骨数性状相关的snp标记位点，该位点为国际猪基因组11.1版本参考序列中猪1号染色体wu_10_2_gl896601_1_56核苷酸位点，在seq id no：1中所述的snp标记位点位于第501位，存在t/g多态性；在苏淮猪中，该位点gg和tg型个体的肋骨数极显著多于tt型的个体；在长大二元杂交猪中，该位点gg型个体的肋骨数显著多于tt型的个体。
8.一种用于检测猪1号染色体上与猪肋骨数性状相关的snp标记的引物对，上游引物为：seq id no：2，下游引物为：seq id no：3。
9.本发明所述的分子标记、所述的引物对在检测猪肋骨数性状和/或猪育种中的应用。
10.一种检测所述的猪1号染色体上与猪肋骨数性状相关的snp标记的方法，包含pcr扩增国际猪基因组11.1版本参考序列中猪1号染色体wu_10_2_gl896601_1_56核苷酸位点的一段序列，对扩增产物进行测序，判读该位点的t/g多态性。
11.作为本发明的一种优选，利用本发明所述的引物对对猪基因组dna进行pcr扩增。
12.作为本发明的进一步优选，所述的方法包括以下步骤：
13.(1)取猪组织样品提取总dna；
14.(2)用已提取的猪基因组dna为模板，使用本发明所述的引物对进行pcr扩增；
15.(3)扩增产物进行测序，分析测序结果，判读在seq id no：1第501位的t/g多态性。
16.本发明所述的分子标记在筛选多肋骨数猪群体或新品系中的应用。
17.本发明所述的引物对在筛选多肋骨数猪群体或新品系中的应用。
18.一种筛选多肋骨数猪群体的方法，包括检测苏淮猪国际猪基因组11.1版本参考序列中猪1号染色体wu_10_2_gl896601_1_56核苷酸位点的基因型，选育wu_10_2_gl896601_1_56核苷酸位点的gg型和tg型个体优先作为后备种猪留种。
19.作为本发明的一种优选，检测国际猪基因组11.1版本参考序列中猪1号染色体wu_10_2_gl896601_1_56核苷酸位点的基因型的方法选自pcr或基因测序。
20.一种筛选多肋骨数猪群体的方法，包括检测长大二元杂交猪国际猪基因组11.1版本参考序列中猪1号染色体wu_10_2_gl896601_1_56核苷酸位点的基因型，选育wu_10_2_gl896601_1_56核苷酸位点为gg型个体作为后备种猪留种。
21.作为本发明的一种优选，检测国际猪基因组11.1版本参考序列中猪1号染色体wu_10_2_gl896601_1_56核苷酸位点的基因型的方法选自pcr扩增或基因测序。
22.有益效果
23.本发明开发了猪1号染色体上与猪肋骨数相关的snp标记，并且提供了检测该标记的引物对和方法。通过鉴定该snp标记的基因型来筛选具有多肋骨数的猪品系。该品系的建立能够提高猪的产肉性能，并且产生更多的社会和经济效益。
附图说明
24.图1为猪1号染色体mthfd1l基因wu_10_2_gl896601_1_56位点pcr扩增胶图。
25.图2为猪1号染色体mthfd1l基因wu_10_2_gl896601_1_56位点分型图示例。
26.a为tt型，b为tg型，c为gg型。
具体实施方案
27.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
28.实施例1
29.1试验动物来源
30.苏淮猪来源于江苏省淮安市淮阴新淮种猪场，长大二元杂交猪来源于江苏省淮安市苏食肉品有限公司。
31.2提取猪基因组dna
32.分别采集458头苏淮猪耳组织样及673头长大二元杂交猪肌肉样1份用于dna提取；
33.参考天根生物科技公司组织dna提取试剂盒说明书，提取步骤如下：
34.①
先在缓冲液gd和漂洗液pw中分别加入68ml和200ml无水乙醇，充分混匀。
35.②
剪取耳组织或肌肉样约100mg置于2ml ep管内，完全剪碎后加200μl缓冲液ga，
振荡至彻底悬浮。
36.③
加入20μl蛋白酶k溶液，混匀后放在56℃金属浴中消化过夜，直至组织样溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
37.④
加入200μl缓冲液gb，充分颠倒混匀，放在70℃金属浴10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
38.⑤
加人200μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
39.⑥
将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中，吸附柱放入收集管中，随后以12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放回收集管中。
40.⑦
向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中
41.⑧
向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw，以12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。
42.⑨
重复操作步骤
⑧
。
43.⑩
将吸附柱cb3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
44.将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液te，室温放置2-5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，将离心得到的溶液再加入吸附柱cb3中，室温放置2min，12,000rpm离心2min将溶液收集到离心管中。
45.使用nanodrop-2000分光光度计检测dna的质量与浓度，dna浓度均稀释至50ng/μl，-20℃下保存备用。
46.3目的片段pcr扩增与测序
47.以猪基因组dna为模板进行pcr扩增，反应体系包括dna模板1μl、seq id no：2和seq id no：3所示的引物各1μl、pcr mix 22μl；扩增程序如下：
[0048][0049]
扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，产物片段大小约455bp，电泳结果如图1所示。将剩余的扩增产物进行测序，测序结果用dnaman软件对比验证序列的准确性，使用chromas软件对wu_10_2_gl896601_1_56位点判型。
[0050]
4统计分析
[0051]
使用sas 9.4软件的一般线性模型进行基因型和表型的关联分析，模型如下：y
ijk
＝μi+bj+gk+e
jk
[0052]
其中，yijk为个体的肋骨数；μi代表群体肋骨数均值；bj代表屠宰批次的固定效应；gk
为snp标记的固定效应；e
jk
是残差。
[0053]
5结果
[0054]
表1展示了wu_10_2_gl896601_1_56位点不同基因型对苏淮猪和长大二元杂交猪肋骨数的影响结果。结果表明，在苏淮猪群体中，wu_10_2_gl896601_1_56位点基因型与肋骨数表型极显著关联(p《0.01)。其中，gg和tg型个体的肋骨数极显著多于tt型的个体(p《0.01)，gg型个体的肋骨数与tg型的的肋骨数差异不显著(p》0.05)。在长大二元杂交猪群体中，wu_10_2_gl896601_1_56位点基因型与肋骨数表型显著关联(p《0.05)。gg型个体的肋骨数显著多于tt型的个体(p《0.05)，而tg型与gg和tt型个体的肋骨数差异不显著(p》0.05)。
[0055]
因此，在苏淮猪中继代选育wu_10_2_gl896601_1_56位点gg型和tg型个体，有利于增加苏淮猪群体的肋骨数，进而提高苏淮猪的产肉性能。在长大二元杂交配套系中，在长白和大白父母代中，选育wu_10_2_gl896601_1_56位点为gg型个体，有利于增加长大二元杂交猪的肋骨数，进而提高长大二元杂交猪的产肉性能。
[0056]
表1猪1号染色体mthfd1l基因wu_10_2_gl896601_1_56位点与苏淮猪肋骨数关联分析
[0057][0058]
注：同行数字肩标不同的大写字母表示差异极显著(p《0.01)，不同的小写字母表示差异极显著(p《0.05)，n表示对应基因型下的个体数。