拉萨大黄中分离的化合物及其在治疗神经系统疾病中的用途

拉萨大黄中分离的化合物及其在治疗神经系统疾病中的用途
1.本技术是申请号为“202011543207.5”，申请日为“2020年12月21日”，发明名称为“拉萨大黄中分离的二苯乙烯类化合物及其在治疗神经系统疾病中的用途”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及二苯乙烯类化合物，尤其拉萨大黄中分离的二苯乙烯类化合物，本发明进一步涉及二苯乙烯类化合物及其在制备治疗神经系统疾病药物中的用途，属于从植物中分离的二苯乙烯类化合物及其用途领域。


背景技术：

3.拉萨大黄(rheum lhasaense a.j.li et p.k.hsiao)是蓼科大黄属波叶组植物，为我国特有种。其野生种主要分布西藏，目前，在四川和云南的一些地区也开始人工栽培。拉萨大黄作为一种民族药，常被用于治疗胃部疾病，西藏当地人称其为曲扎。早期的文献分析发现，拉萨大黄并不含有大黄属植物的特征性成分——蒽醌和蒽酮类衍生物，在化学成分上表现出重大的特殊性。目前，关于拉萨大黄的研究报道较少，仅有两篇文献共报道了其含有12个植物化学成分，且均为二苯乙烯类成分，包括6个白藜芦醇单体衍生物、4个白藜芦醇二聚体和2个白藜芦醇三聚体。二苯乙烯类成分在神经系统疾病的预防治疗中表现出显著的效果，目前，白藜芦醇是被研究最深入的二苯乙烯类成分。一些临床数据显示，白藜芦醇能够有效地改善阿尔兹海默症患者的症状。
4.胆碱假说认为脑组织中乙酰胆碱水平的降低是引起神经退行性疾病的重要因素之一，其中乙酰胆碱酯酶的过度表达可使乙酰胆碱水解程度增强，使得乙酰胆碱的水平降低。乙酰胆碱酯酶抑制剂被看作是预防和治疗阿尔兹海默症等神经退行性疾病的重要药物来源，如多奈哌齐和加兰他敏两种药物是通过作用于胆碱能途径对阿尔兹海默症表现良好的治疗效果。就现有报道而言，可以认为二苯乙烯类成分是拉萨大黄的主要成分，是寻找预防治疗阿尔兹海默症等神经退行性疾病的重要宝库。


技术实现要素：

5.本发明的目的之一是提供从拉萨大黄中分离的新的二苯乙烯类化合物；
6.本发明的目的之二是将所提供新的二苯乙烯类化合物应用于制备治疗神经退行性疾病的药物。
7.本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
8.本发明首先提供了从拉萨大黄中分离的新的二苯乙烯类化合物，其结构式为式ⅰ、式ⅱ或式ⅲ所示：
[0009][0010]
[0011]
本发明中式ⅰ、式ⅱ或式ⅲ所示化合物的酸加成的盐、水合物或前药也包括在本发明之中；所述化合物的酸加成的盐优选为药学上可以接受的适当的酸(例如盐酸、醋酸、硫酸)形成无毒的盐，除了药物上可接受的盐以外，其它的盐也包括在本发明之中。
[0012]
作为参考，本发明提供了一种从拉萨大黄中分离得到式ⅰ、式ⅱ或式ⅲ所示化合物的方法，该方法包括以下步骤：
[0013]
(1)拉萨大黄粉碎后用95％乙醇提取，减压浓缩得到浸膏；(2)浸膏经萃取分为氯仿部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位；(3)将乙酸乙酯部位样品上样于mci填料层析柱中，分别用30％、50％、70％和100％乙醇溶剂淋洗；其中，从50％乙醇洗脱馏分中分离得到式ⅰ化合物和式ⅱ化合物，从70％洗脱馏分中分离得到式ⅲ化合物。
[0014]
其中，步骤(1)中所述的乙醇优选为40-98％乙醇，最优选为95％乙醇；
[0015]
步骤(3)中每个溶剂淋洗4-5个柱体积。
[0016]
本发明体外测定式ⅰ、式ⅱ以及式ⅲ所示三个新化合物(新化合物1，2，3)对乙酰胆碱酯酶的抑制活性，结果显示，式ⅰ(新化合物1)，式ⅱ(新化合物2)对乙酰胆碱酯酶的抑制活性表现出中等程度的抑制作用，而式ⅲ(新化合物3)表现出较强的抑制作用。
[0017]
本发明进一步将新化合物1进行动物实验，经行为学实验nor，mwm，pat及胆碱能检测、氧化应激检测研究和评价新化合物1对东莨菪碱诱导的认知障碍的改善作用。根据小鼠新物体识别能力的实验结果可见，新化合物1可使小鼠对熟悉物体的记忆增强，而且能够显著地改善东莨菪碱诱导的短时、非空间学习记忆损伤。根据小鼠被动逃避能力的实验结果可见，新化合物1能够改善东莨菪碱造成的损伤，使得c57小鼠避暗潜伏期延长，且减少错误次数。根据小鼠水迷宫实验中的学习记忆能力的实验结果可见，新化合物1可显著改善东莨菪碱造成的损伤。根据改善东莨菪碱造成的胆碱能损伤的实验结果可见，新化合物1可有效地逆转东莨菪碱造成的乙酰胆碱水平下降和乙酰胆碱酯酶损伤。根据东莨菪碱造成的氧化损伤的实验结果可见，新化合物1具有良好的抗氧化能力，可逆转东莨菪碱造成的氧化损伤。根据东莨菪碱造成的神经炎症的实验结果可见，化合物1具有显著的炎症抑制作用，减弱炎症性损伤。
[0018]
本发明的另外一个目的是提供一种治疗神经退行性疾病的药物组合物，该药物组合物由预防或治疗上有效量的式ⅰ、式ⅱ或式ⅲ所示化合物或其可药用的盐与药学上可接受的载体配合而成；将药学上可接受用量的式ⅰ、式ⅱ或式ⅲ所示化合物与药学上可接受的载体或辅料配合后，按本领域常规的制剂方法将其制备成任意一种适宜的药物组合物。通常该组合物适合于口服给药和注射给药，也适合其他的给药方法。该组合物可以是片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、锭剂、栓剂或口服液等液体制剂形式。根据不同的给药方法，本发明药物组合物可以含有0.1％-99％重量，优选10-60％重量的式ⅰ、式ⅱ或式ⅲ所示化合物
[0019]
其中，所述的辅料可以是抗氧络合剂、填充剂、骨架材料等；所述的药学上可接受的载体是木糖醇、甘露醇、乳糖、果糖、葡聚糖、葡萄糖、聚乙烯吡咯烷酮、低分子右旋糖酐、氯化钠、葡萄糖酸钙或磷酸钙中的一种或几种，优选为甘露醇或乳糖。
[0020]
其中，所述的神经退行性疾病包括阿尔茨海默病(ad)、帕金森病(pd)或亨廷顿病(hd。
[0021]
本发明技术方案详述
[0022]
拉萨大黄药材经粉碎后，用95％乙醇提取，减压浓缩得到浸膏。经萃取分为氯仿部
位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位。乙酸乙酯部位样品上样于mci填料层析柱中，分别用30％、50％、70％和100％乙醇溶剂淋洗，每个溶剂淋洗4-5个柱体积。其中，从50％乙醇洗脱馏分中分离得到化合物1(白皮杉醇-3'-o-β-d-[2
″‑
(3,5-二羟基-4-甲氧基苯甲酰基)]-吡喃葡萄糖苷)和新化合物2(白皮杉醇-3'-o-β-d-(2
″‑
没食子酰基)-吡喃葡萄糖苷)，从70％洗脱馏分中分离得到化合物3(4
′‑
甲氧基-荆三棱素a)。
[0023]
脑组织中乙酰胆碱水平的降低是引起阿尔兹海默症等神经退行性疾病的重要因素之一，因此乙酰胆碱酯酶抑制剂是寻找预防治疗重要宝库。检测，本发明体外测定三个新化合物(化合物1，2，3)对乙酰胆碱酯酶的抑制活性，结果显示，化合物1，2对乙酰胆碱酯酶的抑制活性表现出中等程度的抑制作用，而化合物3表现出较强的抑制作用。化合物1，2和3活性显著高于白藜芦醇(化合物4)和曲扎茋苷(化合物5)(p《0.0001)。
[0024]
由体外活性实验可知拉萨大黄中新化合物1具有良好的胆碱酯酶抑制活性和神经系统保护作用，由于分离得到的新化合物1的量相对较多，且体外活性良好，因此，选用新化合物1进行动物实验，经行为学实验nor，mwm，pat及胆碱能检测、氧化应激检测研究和评价新化合物1对东莨菪碱诱导的认知障碍的改善作用。
[0025]
根据新化合物1提高小鼠新物体识别能力的实验结果可见，通过灌胃给药新化合物1可使小鼠对熟悉物体的记忆增强，而且能够显著地改善东莨菪碱诱导的短时、非空间学习记忆损伤。根据新化合物1提高小鼠被动逃避能力的实验结果可见，化合物1能够改善东莨菪碱造成的损伤，使得c57小鼠避暗潜伏期延长，且减少错误次数。根据新化合物1改善小鼠水迷宫实验中的学习记忆能力的实验结果可见，新化合物1可显著改善东莨菪碱造成的损伤。根据新化合物1改善东莨菪碱造成的胆碱能损伤的实验结果可见，新化合物1在低剂量和高剂量给药下，可有效地逆转东莨菪碱造成的乙酰胆碱水平下降和乙酰胆碱酯酶损伤。根据新化合物1改善东莨菪碱造成的氧化损伤的实验结果可见，新化合物1具有良好的抗氧化能力，可逆转东莨菪碱造成的氧化损伤。根据新化合物1改善东莨菪碱造成的神经炎症的实验结果可见，化合物1具有显著的炎症抑制作用，减弱炎症性损伤。
附图说明
[0026]
图1化合物1、2、3的主要hmbc相关示意式。
[0027]
图2从拉萨大黄中分离的新化学的ic50值(****,p《0.0001)。
[0028]
图3通过小鼠新物体识别能力实验检测新化合物1阻止scop处理的学习记忆障碍；模型组：scopolamine(1.5mg
·
kg-1)；dnpz:donepezil(3mg
·
kg-1)；化合物1_l(100mg
·
kg-1)；化合物1_h(400mg
·
kg-1)。实验值用平均值
±
sem表示(n＝15per group).*《0.05,**《0.01,***《0.001,****《0.0001与模型组比较。
[0029]
图4通过被动逃避能力实验测定化合物1阻止scop处理的学习记忆障碍；(a)进入暗室的潜伏期潜.(b)进入暗室被电的错误次数.模型组:scopolamine(1.5mg
·
kg-1
)；dnpz:donepezil(3mg
·
kg-1
)；化合物1_l(100mg
·
kg-1
)；化合物1_h(400mg
·
kg-1
).实验值用平均值
±
sem表示(n＝15per group).*《0.05,**《0.01,***《0.001,****《0.0001与模型组比较。
[0030]
图5通过水迷宫实验测定化合物1阻止scop处理的学习记忆障碍；(a)逃逸潜伏期.(b)目标平台的穿台次数.(c)游泳速度.(d)穿越目标象限次数.(e)水箱里老鼠的游动轨迹；红色小圆表示隐藏的平台位置，绿色曲线表示运动轨迹.模型组:scopolamine(1.5mg
·
kg-1
)；dnpz:donepezil(3mg
·
kg-1
)；化合物.1_l:化合物1(100mg
·
kg-1)
；化合物1_h:化合物1(400mg
·
kg-1
).实验值用平均值
±
sem表示(n＝15per group).*《0.05,**《0.01,***《0.001,****《0.0001与模型组比较。
[0031]
图6新化合物1改善scop小鼠胆碱能神经系统的作用实验；(a)脑内乙酰胆碱水平.(b)脑内乙酰胆碱酯酶活性.(c)脑内chat活性t.模型组:scopolamine(1.5mg
·
kg-1
)；dnpz:donepezil(3mg
·
kg-1
)；化合物1_l:化合物1(100mg
·
kg-1)
；化合物1_h:化合物1(400mg
·
kg-1
).实验值用平均值
±
sem表示(n＝15per group).*《0.05,**《0.01,***《0.001,****《0.0001与模型组比较。
[0032]
图7新化合物1改善scop治疗小鼠的氧化应激状态实验结果；(a)脑内sod活性.(b)脑内cat活性.(c)脑内gsh水平.(d)脑内mda水平.模型组:scopolamine(1.5mg
·
kg-1
)；dnpz:donepezil(3mg
·
kg-1
)；化合物1_l:化合物1(100mg
·
kg-1)
；化合物1_h:化合物1(400mg
·
kg-1
).实验值用平均值
±
sem表示(n＝15per group).*《0.05,**《0.01,***《0.001,****《0.0001与模型组比较。
[0033]
图8新化合物1改善东莨菪碱造成的神经炎症实验；(a)血清中il-1β水平.(b)血清中il-6水平.(c)血清中tnf-a水平.m模型组:scopolamine(1.5mg
·
kg-1
)；dnpz:donepezil(3mg
·
kg-1
)；化合物1_l:化合物1(100mg
·
kg-1)
；化合物1_h:化合物1(400mg
·
kg-1
).实验值用平均值
±
sem表示(n＝15per group).*《0.05,**《0.01,***《0.001,****《0.0001与模型组比较。.
具体实施方式
[0034]
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
[0035]
材料、药物和试剂
[0036]
拉萨大黄根及根茎收集于西藏自治区林周县，由钟国跃教授(江西中医药大学中药材与民族医药自然资源研究中心)鉴定，样本保存于中国医学科学院药用植物研究所亲缘中心。
[0037]
乙酰胆碱酯酶(ache,1002652214)、丁酰胆碱酯酶(buche,1002399384)、5,5-二硫代比斯[2-硝基苯甲酸](dntb,1002473536)、碘化硫代乙酰胆碱(atci,101792824)、碘化硫代丁酰胆碱(btci,101758768)和他克林(1002020029)分别从sigmaaldrich公司购得。用ph8.0的磷酸缓冲盐(50mm)(hyclone laboratories,美国)制备酶溶液。十二烷基硫酸钠(sds)来自国药集团化学试剂有限公司。
[0038]
东莨菪碱(aladdin，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；盐酸多奈哌齐(aladdin，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；羧甲基纤维素钠(solarbio，北京索莱宝科技有限公司)；生理盐水(石家庄四药有限公司)。
[0039]
实施例1从拉萨大黄中分离二苯乙烯类化合物及其表征
[0040]
1.从拉萨大黄中提取分离二苯乙烯类化合物
[0041]
拉萨大黄药材经粉碎后，用95％乙醇提取，减压浓缩得到浸膏。经萃取分为氯仿部
位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位。乙酸乙酯部位样品上样于mci填料层析柱中，分别用30％、50％、70％和100％乙醇溶剂淋洗，每个溶剂淋洗4-5个柱体积。其中，从50％乙醇洗脱馏分中分离得到化合物1和2，从70％洗脱馏分中分离得到化合物3。
[0042]
2.新化合物结构解析
[0043]
化合物1：棕色粉末，由(+)hresims给出的分子离子峰m/z 595.1423[m+na]
+
(calcd for 595.1428，见附图1)确定其分子式为c
28h28o13
，其不饱和度为15。化合物1的1h nmr谱(见附图2-3)：芳香区氢信号δh7.25(1h,d,j＝2.0hz,h-10),7.05(1h,dd,j＝8.4,2.0hz,h-14)和6.77(1h,d,j＝8.3hz,h-13)为abx系统，δ
h 6.44(2h,d,j＝2.2hz,h-2,6)和6.17(1h,t,j＝2.2hz,h-4)为ax2系统，δ
h 6.87(1h,d,j＝16.2hz,h-8)和6.73(1h,d,j＝16.3hz,h-7)为反式烯烃质子，这些质子信号表明化合物1含有白皮杉醇单元，δ
h 7.15(2h,s,h-2',6')结合δ
c 166.18(羰基信号)确定为没食子酰基单元。此外，一个甲氧基(3.85,s,3h)和糖信号也被观察到。在
13
c nmr谱中可以观察到28个碳信号(见附图4-6)，通过碳、氢信号以及文献值可确定基本结构为白皮杉醇-3'-o-β-d-吡喃葡萄糖苷。糖的次甲基质子在δh5.23(1h，j＝8.0hz)为三重峰，结合hmbc谱中确定为糖的c-2”上质子，且此质子与δ
c 166.18(羰基信号)相关(见附图7-9)，确定没食子酰基连接在糖的2位碳。在hmbc谱可观察到甲基氢与c-4'(δc139.90)相关(见附图7-9)。最后，确定化合物1为白皮杉醇-3'-o-β-d-[2
″‑
(3,5-二羟基-4-甲氧基苯甲酰基)]-吡喃葡萄糖苷。1h nmr和
13
c nmr数据归属见表1.
[0044]
化合物2：棕色粉末，由(+)hresims给出的分子离子峰m/z 581.1265[m+na]
+
(calcd for 581.1271，见附图10)确定其分子式为c
27h26o13
，其不饱和度为15。化合物2除了缺少甲氧基信号外，其他的1h nmr和
13
c nmr数据与化合物1相似。1h nmr谱(见附图11-14)：含有典型的白皮杉醇信号一个abx系统：δ
h 7.23(1h,d,j＝2.0hz),7.04(1h,dd,j＝8.3,2.0hz)和6.76(1h,d,j＝8.3hz)，和ax2系统：δ
h 6.44(2h,d,j＝2.2hz)和6.16(1h,t,j＝2.2hz),以及反式烯烃质子δ
h 6.87(d,j＝16.2hz)和6.72(d,j＝16.3hz)。此外，通过hmbc谱中糖2位次甲基氢(δ
h 5.19)与羰基(δ
c 166.68)相关可以确定没食子酰基连接在糖基2位(见附图17-19)，说明化合物2为白皮杉醇-3'-o-β-d-(2
″‑
没食子酰基)-吡喃葡萄糖苷，1h nmr和
13
c nmr数据归属见表1.
[0045]
化合物3：棕色粉末，其分子式经uplc-q-tof-ms测定为c
29h24
o7(m/z 485.1601[m+h]
+
，计算公式为485.1556)，结合
13
c和1h nmr数据分析，其不饱和度为18。1h nmr的芳香区，在δ
h 6.88(2h，d，j＝8.4hz，h-3，5)和7.30(2h，d，j＝8.3hz，h-2，6)处有一组aa
′
bb
′
偶联质子，表明结构中含有一个对位取代的苯基。在δ
h 6.67(1h，d，j＝2.1hz，h-14)和6.31(1h，d，j＝2.1hz，h-12)为ax型的一组芳香质子；还有其他芳香信号：δ
h 6.10(3h，s，2
′
，4
′
，6
′
)，δ
h 6.74(2h，h-10
′
，13
′
)和6.62(1h，dd，j＝8.1，2.1hz，h-14
′
)。δ
h 5.31(1h，d，j＝4.9hz，h-8
′
)和4.44(1h，d，j＝4.9hz，h-7
′
)处的脂肪族质子和δ
h 6.94(1h，d，j＝16.4hz，h-7)和6.71(1h，d，j＝16.4hz，h-8)处的反式双键质子被看作为二苯乙烯类二聚体成分的典型质子。除上述质子外，化合物3还有一个甲氧基基团δh3.74(3h，s)。化合物3的
13
c nmr谱表现出29个碳信号，其中包含一个甲氧基基团、16个甲基和12个季碳。除了多出一个甲氧基基团外，化合物1的1h和
13
c nmr数据与scirpusin a的nmr数据一致。h-7
′
(δ
h 4.4)与c-2
′
、6
′
(δ
c 105.9)存在hmbc相关，h-8
′
(δ
h 5.31)与c-10
′
(113.2)、c-14
′
(117.3)存在hnbc相关，说明化合物3的结构与scirpusin a是一致的。另外，在hmbc谱中可观察到甲基质子(δ
h 3.74)与
c-4(δ
c 159.5)存在相关，得出甲氧基基团位于c-4的结论。化合物3的二氢苯并呋喃骨架在c-7
′
和8
′
处是两个手性中心，c-7
′
和8
′
处两个质子的耦合常数(j)为4.9hz，表明为反式。根据一些白藜芦醇低聚物的1hnmr数据可知，顺式取向时的耦合常数值应在8.0hz左右。且h-7
′
和h-8
′
之间不存在noesy相关，进一步指出了h-7
′
和h-8
′
的反方向性。二氢苯并呋喃骨架在c-7
′
和8
′
处的构型可通过220-240nm区域的cotton效应判别，如(+)-εviniferin(7
′
s，8
′
s)在237nm处为正cotton效应，(-)-εviniferin(7
′
r，8
′
r)为负cotton效应。化合物3的cd谱在231nm处表现出负cotton效应(δε，-13.17)，说明c-7
′
和c-8
′
处的绝对构型为7
′
r，8
′
r。因此，化合物3的结构被阐明为4
′‑
methoxy-scirpusin a(4
′‑
甲氧基-荆三棱素a)。
[0046]
表1化合物1和化合物2的1h nmr和
13
c nmr数据
[0047][0048][0049]b表示数据在氘代甲醇中测定。
[0050]
*
表示多重重叠峰。
[0051]
表2化合物3的1h nmr和
13
c nmr数据
[0052][0053]
实验例1乙酰胆碱酯酶(ache)抑制活性筛选实验
[0054]
1.试验方法
[0055]
乙酰胆碱酯酶抑制活性是基于ellman方法改良后，在96孔板中测定化合物1和2对ache抑制作用。实验中使用的试剂包括反应底物atci，显色剂dtnb和反应终止剂的1％sds缓冲液含(1g sds的pbs(ph8.0))。测定步骤如下：首先，将60μl pbs(ph 8.0)，10μl 3mm的dtnb，20μl被测化合物和20μl 0.50u/ml ache溶液混合在96孔板，在37℃下孵育10分钟以激活酶；其次，将10μl底物(atci)加入到微孔板中，并在37℃下孵育15分钟。第三，加入80μl的1％sds溶液终止反应。最后，使用多功能酶标仪(tecan infinite m200，switzerland tecan trading co.，ltd)在405nm下测定吸光度。用20μl pbs替代样品溶液用作空白样品，以记录空白吸收，以他克林作为作为抑制乙酰胆碱酯酶的阳性对照。其中，每个样品重复三次。根据公式(1)计算细胞存活率(％)
[0056]
抑制率(％)＝1-(a样品-a背景)/(a空白-a背景)
×
100
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(1)数据处理
[0057]
应用ibm spss statistics v23.0软件对数据进行统计分析，结果用mean
±
standard error mean(sem)的方式表示。符合正态分布的数据进行单因素方差分析(one-way anova)，组间差异通过lsd analysis进行两两比较；不满足正态分布的数据采用非参数检验。分析结果用graphpad prism software 8.0绘制图表。
[0058]
2.试验结果
[0059]
脑组织中乙酰胆碱水平的降低是引起阿尔兹海默症等神经退行性疾病的重要因素之一，因此乙酰胆碱酯酶抑制剂是寻找预防治疗重要宝库。经体外测定三个新化合物(化合物1，2，3)对乙酰胆碱酯酶的抑制活性，结果显示，化合物1，2对乙酰胆碱酯酶的抑制活性表现出中等程度的抑制作用，而化合物3表现出较强的抑制作用。化合物1，2和3活性显著高于白藜芦醇(化合物4)和曲扎茋苷(化合物5)(p《0.0001)，结果见表3及图2。从化学结构角度来看，化合物1和2是在化合物5的基础上在糖基上发生酰基化反应后生成，这种结构上的变化明显提高了对乙酰胆碱酯酶的抑制作用，为结构改造提供了参考。总之，在拉萨大黄根
部分离到的两个新化合物对乙酰胆碱酯酶表现出明显抑制作用，是有望用于预防阿尔兹海默症等疾病的潜在药物。
[0060]
表3 5个二苯乙烯类成分对乙酰胆碱酯酶活性的抑制结果
[0061][0062][0063]
实验例2化合物1的动物实验和行为学实验
[0064]
1实验方法
[0065]
1.1动物实验
[0066]
动物实验主要研究新化合物1(comp.1，白皮杉醇-3'-o-β-d-[2
″‑
(3,5-二羟基-4-甲氧基苯甲酰基)]-吡喃葡萄糖苷)对认知障碍的预防作用。8周龄的spf级c57雄性小鼠60只(购自斯贝福(北京)生物技术有限公司)，于塑料鼠笼中喂养，自由进食和进水，室温25
±
2℃，湿度为55
±
10％，维持12h光照和12h黑暗的昼夜节律。雄性小鼠随机分为5组(每组12只小鼠)：(1)空白对照组(control，vehicle)、(2)模型组(model，scopolamine,1.5mg
·
kg-1
)、(3)阳性药组(dnp，scopolamine+donepezil，3.0mg
·
kg-1
)、(4)低剂量组(化合物1，scopolamine+comp.1,70mg
·
kg-1
)、(5)高剂量组(化合物1，scopolamine+comp.1,350mg
·
kg-1
)。持续4周给小鼠灌胃服用化合物1，在行为学实验当天，给药0.5h后，除空白组均腹腔注射东莨菪碱，并于造模0.5h后开始行为学实验。
[0067]
1.2行为学实验
[0068]
1.2.1新物体识别(novel object recognition test,nor)
[0069]
新物体识别实验是评估小鼠学习和记忆能力的重要方法，在神经退行性疾病的研究中发挥重要的作用。实验装置由一个白色实验箱(长:40cm；宽:40cm；高:40cm)和动物行为学视频分析系统(supermaze,上海欣软信息科技有限公司)组成。实验过程分为3个阶段：适应期、熟悉期、测试期。适应期为1天，将动物背对箱体依次放入实验箱中部位置后开始使之适应实验箱环境5min，用70％的乙醇清洗仪器以消除残留的气味。次日进行熟悉期和测试期。熟悉期，在实验箱中放入两个相同物体，并保持两个物体与墙壁距离一致，将动物放入实验箱中自由探索5min。间隔30min后开始测试期，将其中一个熟悉物体变换为新物体，另一熟悉物体保持不变，将动物再次放入实验箱中探索5min。记录小鼠在测试期内对新物体和原熟悉物体的探索时间，用相对辨别指数(discrimination index,di)来评价动物的学习记忆能力。相对辨别指数计算公式为di＝(n-f)/(n+f)
×
100％，其中n(new)为动物对新物体的探索时间，f(familiar)为动物对原熟悉物体的探索时间。
[0070]
1.2.2莫里斯水迷宫(morris water maze test,mwm)
[0071]
空间学习记忆能力通过morris水迷宫实验进行评估，实验参照morris水迷宫经典方案并进行改进。morris水迷宫动物行为分析系统包括一个黑色水池(直径:100cm；高度:50cm)，黑色平台(直径:9cm；高度:15cm)和动物行为学视频分析系统。将水池分为四个象限(东南象限、东北象限、西南象限、西北象限)，在象限池壁的中点粘贴不同形状的彩色纸，作为小鼠找到平台的标记。平台位于目标象限中心水下1.5cm处，在整个训练期间保持位置不变。为了不让小鼠看到水面下的平台，在水池中加入牛奶，并搅匀。
[0072]
mwm实验第1天到第5天为定位航行阶段，每只小鼠每天上午和下午各训练1次，分别从两个固定位置面壁放入老鼠。每只老鼠允许60s时间寻找平台，若成功找到平台则让其在平台上停留15s再归笼，系统自动记录到达平台的潜伏期；若未找到平台则引导动物至平台，停留15s(潜伏期记为60s)。
[0073]
第6天为空间探索阶段，撤除平台，检测动物对平台位置的空间记忆能力。从平台的对角象限中点将动物面壁放入水中，系统自动记录动物在60s内穿越目标象限次数、穿越平台次数，平台象限的游泳时间比、游程比等指标。
[0074]
1.2.3避暗实验(passive avoidance test,pat)
[0075]
避暗实验装置由一个明室和一个暗室组成，两室通过一个拱门相连。实验分为避暗学习和避暗巩固两个阶段。实验前每只小鼠背朝拱门放入明室自由探索3min，然后开始
学习，将小鼠背朝拱门放入明室，当其进入暗室时，给予0.36ma的电击，共学习5min。学习24h后进行巩固实验，仍将小鼠按原方式放入明室，记录5min内的进入暗室的错误次数和第一次进入暗室的潜伏期。
[0076]
1.3生化指标检测
[0077]
在行为学实验结束后，所有小鼠吸入乙醚麻醉。从眼内眦静脉收集血液，并在4℃下以3500rpm离心10分钟分离血清样品。然后将小鼠脱颈断头，在冰上取出脑组织并称重。用9倍于组织重量的冰冷生理盐水快速匀浆，并于4℃以2500r
·
min-1离心10min，收集上清液，使用bca蛋白定量试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司，北京，中国)测定总蛋白浓度。ache、chat、sod、cat活性及ach、gsh、mda水平的检测均参照相应检测试剂盒说明书进行操作(南京建成生物工程研究所，南京，中国)。其中ache、chat、sod、cat活性以u
·
mgprot-1
表示，gsh水平以umol
·
mgprot-1
表示，mda水平以nmol
·
mgprot-1表示，ach水平以ug
·
mgprot-1
表示。血清样品中炎症因子il-1β、il-4、il-6、tnf-a水平的检测均参照相应的elisa检测试剂盒说明书进行操作(北京华英生物技术研究所，北京，中国)，并以ng
·
ml-1
表示。
[0078]
1.4数据处理
[0079]
应用ibm spss statistics v23.0软件对数据进行统计分析，结果用mean
±
standard error mean(sem)的方式表示。符合正态分布的数据进行单因素方差分析(one-way anova)，组间差异通过lsd analysis进行两两比较；不满足正态分布的数据采用非参数检验。分析结果用graphpad prism software 8.0绘制图表。
[0080]
2实验结果
[0081]
2.1新化合物1改善东莨菪碱导致的认知障碍
[0082]
由实验例1的体外活性实验可知拉萨大黄中新化合物1具有良好的胆碱酯酶抑制活性和神经系统保护作用。由于分离得到的新化合物1的量相对较多，且体外活性良好，因此，选用新化合物1进行动物实验，经行为学实验nor，mwm，pat及胆碱能检测、氧化应激检测研究和评价新化合物1对东莨菪碱诱导的认知障碍的改善作用。
[0083]
2.2新化合物1提高小鼠新物体识别能力
[0084]
本实验通过新物体识别实验评价c57小鼠的短时、非空间学习记忆能力。结果可看出，东莨菪碱诱导的认知障碍小鼠对熟悉物体和新物体的记忆和辨别能力减弱，模型组中小鼠的相对辨别指数相对较低。空白组小鼠的相对辨别指数显著大于模型组(p《0.05)，说明正常的c57小鼠对熟悉物体有记忆并能够辨别出熟悉物体和新物体；与模型组相比，dnpz组的相对辨别指数显著升高(p《0.0001)；实验结果如图3所示，与模型组相比，新化合物1给药后，低剂量组(comp.1_l)和高剂量组(comp.1_l)的di值则显著大于0，表明通过灌胃给药新化合物1可使小鼠对熟悉物体的记忆增强而且能够显著地改善东莨菪碱诱导的短时、非空间学习记忆损伤。
[0085]
2.3新化合物1提高小鼠被动逃避能力
[0086]
避暗实验是利用啮齿类动物趋暗避明的习性设计，当动物进入暗室即遭足底电击，反复数次后形成条件反射。该实验用于检测啮齿类动物的被动逃避能力，以进入暗室的潜伏期和进入暗室被电的错误次数为主要评价指标。在避暗实验中，与空白组相比，模型组小鼠的避暗潜伏期显著降低，错误次数显著增加(p《0.0001)；与模型组相比，dnpz组和
comp.1_l和comp.1_h的避暗潜伏期均显著升高(p《0.0001)，comp.1_l组的错误次数显著减少(p《0.05)，comp.1_h组错误次数减少，但未出现显著性差异，如图4(a)、(b)所示。结果表明1.5mg
·
kg-1
东莨菪碱显著损害小鼠在避暗实验中的被动逃避能力。化合物1能够改善东莨菪碱造成的损伤，使得c57小鼠避暗潜伏期延长，且减少错误次数。
[0087]
2.4新化合物1改善小鼠水迷宫实验中的学习记忆能力
[0088]
morris水迷宫实验是用于研究啮齿类动物的空间学习和记忆能力的经典检测方法，常用于考察动物的长时、空间参考记忆能力，包括定位航行阶段和空间探索两个阶段。在定位航行阶段，寻台潜伏期为最经典的评价指标；在空间探索阶段，穿台次数和穿越目标象限次数是评价空间探索能力的主要指标。如图5(e)所示，c57小鼠在5天的定位航行训练中，模型组小鼠寻找平台所需时间明显比空白组小鼠多，而且在空间探索阶段，模型组小鼠第一次到达平台区的潜伏期显著增加，穿越目标象限和平台区次数显著减少(p《0.01)，如图5(a)、(b)、(c)、(d)所示。新化合物1以100和400mg
·
kg-1
给药时能够显著降低了小鼠第一次到达平台区的潜伏期(p《0.0001)，以400mg
·
kg-1
给药时显著增加了穿越目标象限次数(p《0.05)和平台区次数(p《0.05)。各组小鼠游泳速度无明显差异，如图5(c)所示。本研究结果表明1.5mg
·
kg-1
东莨菪碱显著损害小鼠在水迷宫实验中的空间学习记忆能力，新化合物1可显著改善东莨菪碱造成的损伤，100和400mg
·
kg-1
给药时的作用相当。
[0089]
2.5新化合物1改善东莨菪碱造成的胆碱能损伤
[0090]
通过检测小鼠脑组织中乙酰胆碱转移酶(ache)、乙酰胆碱转移酶(chat)活性和乙酰胆碱(ach)水平来评价新化合物1对东莨菪碱造成的胆碱能损伤的作用。如图6(a)、(b)所示，东莨菪碱导致c57小鼠脑组织中ach水平和ache活性显著下降(p《0.05)；口服化合物1可显著升高ach水平和ache活性(p《0.05)。小鼠脑组织中acht的活性变化并不是特别明显，但相比模型组，化合物1在高剂量下可使acht活性也显著升高(p《0.05)，如图6(c)所示。研究结果表明，c57小鼠口服1.5mg
·
kg-1
东莨菪碱致使脑组织中乙酰胆碱水平显著下降，而且乙酰胆碱酯酶和乙酰胆碱转移酶活性发生异常。化合物1在低剂量和高剂量给药下，可有效地逆转东莨菪碱造成的乙酰胆碱水平下降和乙酰胆碱酯酶损伤。
[0091]
2.6新化合物1改善东莨菪碱造成的氧化损伤
[0092]
大脑是极易受氧自由基损伤的组织，因此氧化应激损伤同样是造成ad的一大重要因素。本研究中，模型组东莨菪碱降低了小鼠脑组织的抗氧化活性，使cat、sod活性以及gsh水平下降，同时升高mda水平，增加了脑组织自由基损伤程度。化合物1给药可不同程度提高小鼠脑组织抗氧化活性，降低mda水平。其中低剂量组和高剂量组cat活性相对模型组显著增加(p《0.05)，结果如图7(a)所示。dnp组和低剂量组gsh水平显著升高(p《0.01)，高剂量组gsh水平有明显升高，但未出现显著性差异，结果如图7(b)所示。dnp组和高剂量组sod活性显著升高(p《0.05)，同时各给药组均有降低脑组织mda水平的趋势，但均未出现显著性差异，结果如图7(c)、(d)所示。以上结果表明1.5mg
·
kg-1
东莨菪碱造成了氧化应激损伤，同时化合物1具有良好的抗氧化能力，可有效逆转东莨菪碱造成的氧化损伤。
[0093]
2.7新化合物1改善东莨菪碱造成的神经炎症
[0094]
本研究中，腹腔注射东莨菪碱使模型组c57小鼠的血清中il-1β、il-6、tnf-a水平相对空白组显著升高(p《0.0001)，而且腹腔注射东莨菪碱也使各给药组的c57小鼠出现不同程度的炎症性损伤。与模型组相比较，化合物1以400mg/kg给药时可使c57小鼠血清中的
il-1β、il-6、tnf-a显著降低水平(p《0.05)。低剂量给药时，可降低il-1β、il-6、tnf-a水平，但并不具显著性，结果如图8(a)、(b)、(c)所示。实验结果表明化合物1在高剂量下具有显著的炎症抑制作用，减弱炎症性损伤。